A intrincada interação da expressão genética nas células vivas é semelhante a uma sinfonia bem orquestrada, com cada gene desempenhando o seu papel em perfeita harmonia para garantir que as células funcionem como deveriam. No centro desta sinfonia estão os fatores de transcrição (TFs), maestros moleculares que regulam a expressão dos genes ligando-se a sequências específicas de DNA conhecidas como promotores.

Desvendar os segredos dessas redes reguladoras em escala genômica requer uma coleção abrangente de perfis de expressão gênica, mas medir as respostas de expressão gênica para cada par de TF e promotor representou um desafio formidável devido ao grande número de combinações potenciais, mesmo em organismos relativamente simples, como como bactérias.

Para enfrentar esse desafio, pesquisadores liderados por Fuzhong Zhang, professor de engenharia energética, ambiental e química na Escola de Engenharia McKelvey da Universidade de Washington em St. Louis, desenvolveram uma técnica chamada respostas agrupadas do promotor ao sequenciamento de perturbação TF (PPTP-seq).

PPTP-seq integra a edição do gene CRISPR com uma biblioteca combinatória contendo todos os TF conhecidos no genoma alvo e os promotores correspondentes. A técnica inovadora permite que os cientistas examinem a regulação genética por centenas de TFs que atuam em milhares de promotores em um único experimento, que leva cerca de duas semanas para ser concluído e produz dados facilmente processáveis.

Em um estudo publicado online em 16 de setembro na Nature Communications , o primeiro autor Yichao Han, que obteve doutorado em engenharia ambiental em 2023 enquanto trabalhava no laboratório de Zhang, usou PPTP-seq para explorar sistematicamente a atividade de 1.372 promotores de E. coli quando submetidos a perturbação de cada um dos 183 TFs.

Este único experimento forneceu informações sobre mais de 200.000 interações potenciais entre promotores de TF, pintando um quadro abrangente do cenário regulatório da E. coli, revelando novas respostas regulatórias e preparando o terreno para a futura exploração genética.

"Como uma ferramenta de biologia sintética, o PPTP-seq permite estudos de alto rendimento da regulação genética", disse Zhang. "A ferramenta mais comumente usada para estudar a regulação genética, o RNA-seq, pode revelar cerca de 4.000 respostas de genes reguladores. O PPTP-seq aumentou esse número em 50 vezes, revelando 200.000 respostas de genes reguladores em um único experimento. Usando este novo e poderoso ferramenta, fomos capazes de fornecer uma rede regulatória abrangente para E. coli em escala genômica."

Além de fornecer muito mais dados, o PPTP-seq também pode capturar as intrincadas nuances da regulação genética em diferentes contextos celulares. Ao submeter a E. coli a vários meios de crescimento, os investigadores descobriram atividades promotoras complexas e regulação genética, oferecendo um vislumbre da adaptabilidade destes microrganismos.

“Mesmo as bactérias simples têm mais de 4.000 genes”, disse Han, que agora é pesquisador do Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico. "Os TFs controlam os níveis de expressão genética, desligando e ligando genes em resposta a estímulos ambientais . No entanto, esses controles nem sempre são diretos. Os efeitos posteriores da ativação de um TF podem envolver múltiplos TFs e genes ."

Han observou que a regulação genética não é um fenômeno único, mas sim um processo bem ajustado, dependente de sinais ambientais. Como a rede de regulação genética é complexa, as ferramentas anteriores para estudá-la revelaram-se onerosas em termos de tempo e esforço necessários. Com sua capacidade de perturbar com precisão TFs individuais usando CRISPR e registrar efeitos a jusante para todas as combinações de TF e promotores, o PPTP-seq revela como diferentes promotores respondem sob diferentes condições, ressaltando a natureza dinâmica da expressão gênica, mesmo em organismos simples.

“Em última análise, o PPTP-seq nos permite realizar estudos de biologia de sistemas com eficiência muito maior – 50 vezes maior do que as abordagens atuais”, disse Zhang. “Nosso trabalho revelou uma rede abrangente de resposta regulatória em bactérias, com muitas respostas até então desconhecidas”.

Esta compreensão mais profunda da regulação celular poderá ter implicações de longo alcance em áreas como a biotecnologia e a medicina. Han apontou especificamente para aplicações potenciais na biofabricação, onde as respostas a jusante recentemente descobertas poderiam ser aproveitadas para programar bactérias para produzir materiais desejados, mesmo sob condições não ideais. Além das bactérias, o PPTP-seq poderia eventualmente ser usado para estudar células mais complexas, incluindo células animais.

“Uma grande vantagem da tecnologia PPTP-seq é que estamos estudando toda a rede de regulação genética de uma só vez, verificando uniformemente todas as interações em várias condições, para que possamos fazer comparações diretas”, disse Han. "No momento, isso é ciência básica. Estamos olhando para a E. coli como um organismo modelo porque ela já foi bem estudada, mas ainda descobrimos coisas novas sobre ela. Isso sugere que haverá ainda mais para aprender à medida que nos expandimos para outras células e aplicações."