Saúde

A tecnologia CRISPR de célula única decifra o papel da acessibilidade da cromatina no câncer
No total, a equipe teve como alvo mais de 100 genes relacionados à cromatina e desenvolveu um
Por New York Genome Center - 29/04/2021


CRISPR-sciATAC é uma nova plataforma de triagem genética integrativa que captura conjuntamente perturbações do gene CRISPR e acessibilidade à cromatina de célula única em todo o genoma. O novo método aproveita a programabilidade do sistema de edição de genes CRISPR para eliminar quase todos os genes relacionados à cromatina em paralelo, oferecendo aos pesquisadores insights mais profundos sobre o papel da acessibilidade ao DNA no câncer e em doenças raras que envolvem a cromatina. Crédito: Sanjana Lab do New York Genome Center e NYU

Em um novo recurso para a comunidade científica, publicado hoje na Nature Biotechnology, pesquisadores do laboratório de Neville Sanjana, Ph.D., do New York Genome Center (NYGC) e da New York University (NYU) desenvolveram o CRISPR-sciATAC, uma nova plataforma de triagem genética integrativa que captura conjuntamente as perturbações do gene CRISPR e acessibilidade à cromatina celular em todo o genoma. Com essa tecnologia, eles traçam o perfil das mudanças na organização do genoma e criam um atlas em grande escala de como a perda de enzimas que alteram a cromatina individual afeta o genoma humano. O novo método aproveita a programabilidade do sistema de edição de genes CRISPR para eliminar quase todos os genes relacionados à cromatina em paralelo, oferecendo aos pesquisadores insights mais profundos sobre o papel da acessibilidade ao DNA no câncer e em doenças raras que envolvem a cromatina.

Avanços recentes nas tecnologias de uma única célula deram aos cientistas a capacidade de traçar o perfil da cromatina, o complexo de DNA e proteínas que reside no núcleo de células individuais. A cromatina é frequentemente chamada de "porteiro" do genoma porque suas proteínas agem como elementos de empacotamento do DNA, promovendo ou recusando o acesso a ele. Isso controla os processos de expressão gênica na célula, como ativar ou desativar genes específicos. Mudanças na paisagem da cromatina têm sido associadas a diversos traços e doenças humanas, principalmente o câncer.

Em uma demonstração inicial do CRISPR-sciATAC, a equipe do Sanjana Lab projetou uma biblioteca CRISPR para atingir 20 genes modificadores da cromatina que são comumente mutados em diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de mama, cólon, pulmão e cérebro. Muitas dessas enzimas atuam como supressores de tumor e sua perda resulta em mudanças globais na acessibilidade à cromatina. Por exemplo, o grupo mostrou que a perda do gene EZH2, que codifica uma histona metitransferase, resultou em um aumento na expressão do gene em vários genes de desenvolvimento previamente silenciados.

"A escala de CRISPR-sciATAC torna este conjunto de dados muito único. Aqui, em um fundo genético uniforme, temos dados de acessibilidade que capturam o impacto de cada gene relacionado à cromatina. Isso fornece um mapa detalhado entre cada gene e como sua perda afeta a organização do genoma com resolução de célula única ", disse a Dra. Noa Liscovitch-Brauer, pós-doutoranda no laboratório de Sanjana no New York Genome Center e na NYU e coautora do estudo.

No total, a equipe teve como alvo mais de 100 genes relacionados à cromatina e desenvolveu um "atlas da cromatina" que mapeia como o genoma muda em resposta à perda dessas proteínas. O atlas mostra que diferentes subunidades dentro de cada um dos 17 complexos de remodelação da cromatina direcionados podem ter efeitos diferentes na acessibilidade do genoma. Surpreendentemente, quase todos esses complexos têm subunidades onde a perda desencadeia maior acessibilidade e outras subunidades com o efeito oposto. No geral, a maior interrupção nos locais de ligação do fator de transcrição, que são elementos funcionais importantes no genoma, foi observada após a perda da proteína 1A contendo o domínio interativo rico em AT ( ARID1A), um membro do complexo BAF. Estima-se que mutações nas proteínas do complexo BAF estejam envolvidas em 1 em cada 5 cânceres.
 
Além do método CRISPR-sciATAC, a equipe também desenvolveu um conjunto de métodos computacionais para mapear os movimentos dinâmicos dos nucleossomos, que são os aglomerados de proteínas que o DNA envolve. Quando há mais nucleossomos, o DNA é fortemente enrolado e menos disponível para ligar os fatores de transcrição. Isso é exatamente o que a equipe encontrou em locais de ligação de fator de transcrição específicos envolvidos na proliferação celular após o knock-out de CRISPR de ARID1A. Ao alvejar uma enzima modificadora da cromatina diferente, esses mesmos locais sofreram uma expansão no espaçamento dos nucleossomos, demonstrando a dinâmica do posicionamento dos nucleossomos em locais específicos do genoma. O método CRISPR-sciATAC permitiu à equipe explorar sistematicamente esta plasticidade do genoma para múltiplas enzimas modificadoras da cromatina e sítios de ligação do fator de transcrição.

"Nós realmente nos concentramos em tornar CRISPR-sciATAC uma técnica acessível - queríamos que fosse algo que qualquer laboratório pudesse fazer. Produzimos a maioria das principais enzimas internamente e usamos métodos simples para o isolamento de uma única célula que não requerem microfluídicos ou kits de célula única ", disse o Dr. Antonino Montalbano, ex-pós-doutorando no laboratório de Sanjana no New York Genome Center e na NYU e coautor do estudo.

Para desenvolver a tecnologia CRISPR-sciATAC, os pesquisadores usaram uma mistura de células humanas e de camundongo para criar um processo de marcação / identificação que lhes permitiu dividir e codificar os núcleos das células, bem como capturar os RNAs de guia único necessários para o direcionamento CRISPR. O trabalho baseia-se no trabalho anterior de indexação combinatória de célula única ATAC-seq (sciATAC-seq) do Dr. Jay Shendure da Universidade de Washington e outros grupos que desenvolvem novos métodos genômicos de célula única. O CRISPR-sciATAC também usa uma transposase única e fácil de purificar que foi desenvolvida no Laboratório de Tecnologia de Inovação de NYGC. Um grande obstáculo técnico foi otimizar as condições experimentais para capturar simultaneamente os RNAs guia CRISPR e fragmentos do genoma para o perfil de acessibilidade, mantendo o envelope nuclear de cada célula intacta.

"Integrando o perfil de acessibilidade da cromatina ao genoma. As telas CRISPR em toda a extensão fornecem uma nova lente para entendermos a regulação do gene ", disse o Dr. Sanjana, membro do corpo docente do NYGC, professor assistente de biologia, NYU e professor assistente de neurociência e fisiologia, NYU Grossman School of Medicine, o estudo autor sênior. "Com o CRISPR-sciATAC, temos uma visão abrangente de como enzimas e complexos modificadores da cromatina específicos mudam a acessibilidade e orquestram as interações que controlam a expressão gênica. A cromatina prepara o terreno para a expressão gênica, e aqui podemos medir o impacto de diferentes mutações na cromatina rapidamente. Esperamos que este atlas seja um recurso amplamente útil para a comunidade e que o CRISPR-sciATAC seja usado para produzir atlas semelhantes em outros sistemas biológicos e contextos de doenças. "

 

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