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Biofilmes funcionais de E. coli responsivos à luz como andaimes para mineralização de hidroxiapatita
Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos à luz como andaimes para mineralização de HA. Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos à luz como andaimes para mineralização de HA. (a) Ilustração esquemática de bio
Por Thamarasee Jeewandara - 02/01/2021


Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos à luz como andaimes para mineralização de HA. Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos à luz como andaimes para mineralização de HA. (a) Ilustração esquemática de biofilmes de E. coli de tipo selvagem compreendendo nanofibras extracelulares de amiloide CsgA, que são os principais componentes da proteína do biofilme que contribuem para a aderência robusta de biofilmes a superfícies sólidas. (b) Ilustração esquemática de Mfps das placas adesivas do mexilhão da Califórnia M. californianus. Mfp3S-pep (abaixo) é um peptídeo adesivo bioinspirado que imita a proteína Mfp3S original encontrada nas placas adesivas de M. californianus. O Mfp3S-pep é enriquecido com resíduos de ácido aspártico (azul), lisina (verde) e tirosina (vermelho), conhecidos por seus papéis funcionais na promoção da nucleação, crescimento e adesão do HA. (c) Esquema mostrando os componentes genéticos do biofilme de E. coli responsivo à luz. O projeto de biofilmes funcionais foi possibilitado pela fusão de sequências que codificam a proteína CsgA e Mfp3S-pep, ambas posicionadas a jusante do elemento de controle transcricional pDawn sensível à luz. No circuito pDawn, a expressão constitutiva da histidina quinase YF1 e seu regulador de resposta cognata FixJ é rigidamente regulada pelo promotor LacIq, enquanto a expressão do repressor de fago λ cI é controlada pelo promotor FixK2. Após a iluminação com luz azul, a atividade da quinase de YF1 e a expressão consequente de cI são ambas inibidas, o que por sua vez ativa o promotor λ pR para promover a expressão de CsgA-Mfp3S-pep. (d) Esquema mostrando a deposição local de minerais HA nas nanofibras extracelulares funcionais compostas por proteínas de fusão CsgA-Mfp3S-pep, secretada por E. coli responsiva à luz projetada, a cepa lightreceiver-CsgA– Mfp3S-pep. (e) Imagem TEM mostrando células e matriz extracelular com fibras amilóides abundantes nos biofilmes. Barra de escala, 500 nm. f, imagem TEM mostrando o compósito formado e cristais semelhantes a ripas precipitados nas superfícies das nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 × SBF. O padrão SAED correspondente apresenta arcos de difração atribuídos aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuídos à fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito: Imagem TEM mostrando o compósito formado e os cristais semelhantes a ripas precipitados nas superfícies de nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 × SBF. O padrão SAED correspondente apresenta arcos de difração atribuídos aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuídos à fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito: Imagem TEM mostrando o compósito formado e os cristais semelhantes a ripas precipitados nas superfícies de nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 × SBF. O padrão SAED correspondente apresenta arcos de difração atribuídos aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuídos à fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito:Nature Chemical Biology , doi: https: //doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Os organismos vivos desenvolveram mecanismos de biomineralização para construir materiais compostos estruturalmente ordenados e ambientalmente adaptáveis. Embora as equipes de pesquisa tenham melhorado significativamente a pesquisa de mineralização biomimética em laboratório, ainda é difícil projetar compósitos mineralizados com características estruturais e componentes vivos muito parecidos com seus equivalentes nativos. Em um novo relatório agora publicado na Nature Chemical Biology , Yanyi Wang e uma equipe de pesquisa em física, materiais avançados, biologia sintética e engenharia na China, desenvolveram compostos vivos padronizados e gradientes inspirados em materiais naturais graduados. Eles acoplaram a formação de biofilme bacteriano induzível por luz com hidroxiapatita biomimética(HA) mineralização neste trabalho, para mostrar como a localização e o grau de mineralização podem ser controlados. As células nos compostos permaneceram viáveis ​​enquanto detectavam e respondiam aos sinais ambientais. Os compósitos mostraram um aumento de 15 vezes no módulo de Young (isto é, rigidez, a razão entre tensão e deformação) após a mineralização. O trabalho lança luz para desenvolver compósitos vivos com capacidade de resposta dinâmica e adaptabilidade ambiental.

Biomineralização em laboratório

O organismo vivo pode produzir uma variedade de estruturas compostas orgânico-inorgânicas hierárquicas com base na biomineralização , onde exemplos notáveis ​​incluem os dentes radulares de quitônios, escamas de peixes e mandíbulas de lagostins que cumprem diversas funções biológicas. O tempo e o grau de biomineralização devem ser controlados com precisão pelas células para formar estruturas e funções precisas nos organismos vivos . Pesquisas recentes em mineralização biomimética destacaram a importância de explorar abordagens controladas por células para produzir padrões de vida e compostos graduados como uma área promissora, mas amplamente inexplorada. As disciplinas de biologia sintética e ciência dos materiaisdesencadearam uma série de circuitos genéticos sofisticados e ecológicos para a bioengenharia de uma série de novas funções celulares . Neste trabalho, Wang et al. desenvolveram materiais compostos vivos e bioinspirados por meio do aproveitamento de biofilmes de Escherichia coli indutíveis por luz, juntamente com mineralização biomimética. O trabalho abrirá portas para a integração de células modificadas para produzir materiais mineralizados com características estruturais e vivas.

Mineralização espacialmente controlável de biofilmes indutíveis por luz para compósitos
vivos padronizados. (a) Esquemático da configuração experimental e etapas sequenciais para
a produção de compósitos padronizados vivos. O padrão de folha azul representado na
ilustração foi projetado em uma placa de Petri contendo a cepa lightreceiver-CsgA-Mfp3S-
pep suspensa em meio. A luz azul desencadeia a formação de biofilme funcional através
da expressão regulada por luz das proteínas CsgA-Mfp3S-pep da cepa lightreceiver-CsgA-
Mfp3S-pep. O meio de cultura na placa de Petri foi então substituído por 1,5 × SBF, seguido
de incubação a 37 ° C para formar os compósitos. Após o processo de mineralização, aTc
foi adicionado para induzir a expressão de uma proteína fluorescente vermelha (mCherry).
(b) Imagem da câmera digital dos biofilmes padronizados corados com CV. Barra de escala,
1 cm. (c) Imagens de SEM mostrando a morfologia da superfície dos biofilmes padronizados.
Barras de escala: 2 µm (esquerda), 1 µm (direita). (d) Imagem da câmera digital do composto
mineralizado subsequente que manteve o padrão original. Barra de escala, 1 cm. (e) Imagens
SEM mostrando as microestruturas de superfície do compósito mineralizado. Barras de
escala: 2 µm (esquerda), 1 µm (direita). (f, g) Análise confocal de microscopia de varredura
a laser da viabilidade bacteriana em biofilmes (f) e compósitos (g). Barras de escala, 5 µm.
Observe que o corante SYTO 9 e o PI foram aplicados como agentes de marcação para corar células vivas (verdes) e mortas (vermelhas), respectivamente. (h) Fluorescência induzida do
composto vivo registrado com um sistema ChemiDoc XRS. Barra de escala, 1 cm. i, a
microscopia confocal demonstrou a expressão de mCherry das bactérias no composto. Barra
de escala, 20 µm. j, Imagens confocais de um composto vivo após induzir a expressão de
mCherry e rotulado com calceína, o que indicou uma distribuição homogênea de
componentes orgânicos e minerais inorgânicos dentro dos compostos vivos padronizados.
Barras de escala, 20 µm. Crédito:Nature Chemical Biology , doi: https:
//doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Seleção de módulos de proteína para mineralização de hidroxiapatita (HA) e desenvolvimento de um biofilme sensível à luz

A equipe selecionou proteínas de fusão para projetar a mineralização, promovendo biofilmes de E. coli. Com base em experimentos anteriores , eles selecionaram a proteína Mefp5 - originária de Mytilus edulis , seguida de Mfp3S - originária de Mytilus californianus e outra variante do peptídeo Mfp3S (Mfsp3S-pep) para iniciar a mineralização e promover a adesão. A equipe construiu proteínas de fusão contendo um domínio principal de proteína do biofilme de E. colipara formar proteínas de fusão CsgA-Mfp e confirmou sua secreção potencial de células modificadas. Eles então selecionaram a proteína de fusão CsgA-Mfp3S-pep como representante para a mineralização da hidroxiapatita e conduziram experimentos para verificar a função da proteína para destacar seu papel durante a mineralização e a formação de cristais. Posteriormente, Wang et al. construiu uma cepa formadora de biofilme induzível por luz denominada receptor de luz -CsgA-Mfp3S-pep que pode ser rigidamente regulada por meio de iluminação de luz azul .
 
A cepa sensível à luz pode gerar materiais de biofilme funcionais após iluminação com luz para promover a mineralização de hidroxiapatita (HA). Para validar isso, os cientistas expuseram a cepa sensível à luz à luz azul em uma placa de Petri e usaram a coloração histológica e imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para mostrar a produção de fibras amilóides nos biofilmes. Comparativamente, eles não observaram fibras amilóides em amostras crescidas no escuro. A matriz extracelular projetada também atuou como um modelo para a mineralização de HA no tempo, o que eles confirmaram após 7 dias de incubação com base em técnicas de difração de raios-X (XRD) e espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS).

Formando compostos vivos controlados

Com base na natureza sensível à luz dos biofilmes projetados, Wang et al. formação de biofilme manipulado no espaço-tempo para controlar a formação de compósitos. Eles conseguiram isso iluminando um padrão de folha em culturas de bactérias líquidas em placas de petri de poliestireno que recapitulavam fielmente o padrão de luz projetado sobre os biofilmes bacterianos. Após 7 dias de mineralização, o composto gerado nas placas de Petri manteve o padrão original, conforme observado por meio de microscopia eletrônica de varredura. A abordagem regulada por luz controlou a forma do composto com base em projeções de padrão de grade e resolução espacial de luz em microescala - comparável ao tamanho das bactérias vivas. A equipe então verificou a viabilidade de células vivas e intactas por meio da engenharia dos compostos vivos para expressar proteínas fluorescentes, conforme confirmado por imagens de microscopia confocal . A partir daí, eles utilizaram a análise termogravimétrica para quantificar os componentes inorgânicos dos compósitos mineralizados, onde o material inorgânico aumentou proporcionalmente com o tempo de imersão em fluido corporal simulado (SBF). Wang et al. também comparou o módulo de Young do biofilme usando uma técnica de micro-indentação para mostrar como a mineralização fortaleceu os biofilmes de E. coli para proteger as células.

Compostos de gradiente de densidade controlada

Acoplamento de biofilmes projetados com mineralização para captura e imobilização
robustas de microesferas em substratos. (a) Esquema mostrando a captura e imobilização
de microesferas em uma lâmina de vidro em solução. Microesferas de PS suspensas em meio
de cultura foram capturadas e imobilizadas em um substrato através da formação de
biofilme seguida de mineralização em 1,5 × fluido corporal simulado (SBF). (b) Imagens
fluorescentes mostrando os dois tipos de biofilmes (colunas esquerda e central) e
microesferas imobilizadas de compósito vivo (coluna direita) nos substratos antes (topo)
e após (parte inferior) do desafio com jato de água a uma pressão de descarga constante
de 8 psi. Barras de escala, 100 µm. (c) Quantificação das capacidades relativas de diferentes
biofilmes e compósitos vivos para colar e imobilizar microesferas de PS no substrato. Os
resultados são apresentados como média ± dp Da esquerda para a direita: P = 0,00003,
P = 0,000004. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. As estatísticas são derivadas usando um
teste t bilateral. Os dados são representativos de n = 3 experimentos independentes.
Crédito: Nature Chemical Biology , doi: https: //doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z

Abordagens de engenharia de tecidos enfatizaram a necessidade de identificar precisamente entre os tecidos duros e molespara um desempenho fisiológico bem-sucedido, portanto, a intensidade da luz pode ser ajustada para controlar a densidade e as propriedades mecânicas de materiais vivos projetados. Zhang et al. conseguiu isso expondo culturas de E. coli a diferentes intensidades de iluminação para revelar como a espessura do biofilme diminuía com a diminuição da intensidade da luz azul. Eles também mostraram como a mineralização era fortemente e localmente dirigida pelas proteínas de fusão Mfsp3S-pep projetadas. Em seguida, eles estudaram as propriedades mecânicas locais de regiões iluminadas com micro-indentação para observar um aumento de quatro vezes no módulo de Young para destacar compostos vivos projetados com gradientes minerais ajustáveis ​​e propriedades mecânicas para interfaces regenerativas de tecido para osso em aplicações de engenharia de tecido ósseo .

Implantando compostos vivos para reparo de danos específicos do local

Os cientistas também estudaram a capacidade dos biofilmes projetados para se agregar para reparar danos por colagem de microesferas de poliestireno, junto com a mineralização de HA. Como prova de conceito, eles aplicaram compostos mineralizados vivos para preencher e reparar rachaduras projetadas na superfície de uma placa de Petri de poliestireno. Durante os experimentos, os biofilmes adesivos induzidos por luz capturaram microesferas em solução para preencher o sulco danificado propositalmente criado, enquanto nanofibras em biofilmes agiram como um modelo para a mineralização de hidroxiapatita para consolidar a cimentação induzida por luz sob iluminação de luz azul. Usando microscopia eletrônica de varredura, Wang et al. mostrou como as bactérias e a matriz extracelular circundante aderiram junto com microesferas para ilustrar a função adesiva dos biofilmes vivos. Os compósitos mineralizados HA formaram camadas densas semelhantes a concreto que preencheram o sulco danificado para destacar a funcionalidade de mineralização dos compósitos vivos para maior durabilidade e aplicações de reparo.

Outlook

Desta forma, Yanyi Wang e seus colegas produziram compósitos vivos com padrão bioinspirado e compostos vivos classificados com uma plataforma de biofilme regulada por luz. Os compostos resultantes exibiram capacidade de resposta ambiental semelhante a suas contrapartes nativas. As células dentro dos compósitos permaneceram viáveis ​​e responderam aos estímulos ambientais mesmo após a mineralização. O trabalho abre um caminho para criar compostos orgânicos-inorgânicos vivos e funcionais com recursos adaptativos e de autorreparação com aplicações em biomedicina, medicina regenerativa e biorremediação .

 

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