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Rumo a uma caixa de ferramentas para edição à la carte do microbioma humano
Os insights de vírus que infectam bactérias podem melhorar muito a edição do genoma em diversos micróbios, incluindo os do microbioma humano
Por Gabriel Filsinger e Benjamin Boettner - 23/02/2021

O número de células bacterianas dentro de cada pessoa é aproximadamente igual ao número de células humanas no corpo. Curiosamente, como essas bactérias contribuem para a nossa saúde ou para as doenças ainda é um grande mistério. Pesquisas sobre o microbioma humano, o coletivo bacteriano que habita nosso intestino e outras partes de nosso corpo, mostraram que essas bactérias podem ter uma influência dramática em muitos aspectos da saúde humana por meio de interações com o sistema imunológico, o cérebro e durante o desenvolvimento. Para entender melhor como cepas bacterianas específicas em nossos microbiomas complexos usam nutrientes específicos, produzem metabólitos que beneficiam ou prejudicam nossos sistemas de órgãos e interagem entre si e com as superfícies do corpo, biólogos sintéticos estão tentando identificar os elementos genéticos responsáveis ​​em seus genomas e descobrir como eles contribuem para as diferenças entre pessoas saudáveis ​​e pessoas com doenças. Para fazer isso sistematicamente, eles gostariam de ser capazes de editar precisamente os genomas bacterianos em posições específicas em uma ampla variedade de cepas.

Engenharia de microbioma: limites e oportunidades

Rumo a uma caixa de ferramentas para edição à la carte do microbioma humano
Biólogos sintéticos do Wyss Institute obtiveram percepções críticas sobre o que limita o uso de um método de engenharia de genoma conhecido como “recombineering” em estudos do microbioma humano e sua manipulação, e abre um caminho para uma caixa de ferramentas de engenharia abrangente. Crédito: KJFalkenberg

A quase onipresente ferramenta de edição do genoma CRISPR-Cas tem sido desafiadora para uso amplamente no reino bacteriano, uma vez que a enzima Cas9 mata a maioria das bactérias, em vez de estimular a edição do genoma. Os pesquisadores atuais do microbioma são forçados a recorrer a outras técnicas, incluindo “recombineering” (engenharia genética mediada por recombinação) como método de escolha. A recombinação permite a edição precisa de sequências de DNA em cromossomos bacterianos sem danificá-los (não há cortes ou quebras de DNA e as edições não apresentam cicatrizes). As ferramentas de recombinação atuais são emprestadas de vírus bacterianos chamados bacteriófagos (ou fagos) que se especializam em um pequeno número de cepas bacterianas, mas não podem infectar outras. Os fagos usam suas chamadas "proteínas de anelamento de DNA de fita simples" (SSAPs) para replicar e recombinar seus genomas dentro dessas bactérias. Isso forneceu uma oportunidade para os pesquisadores, que por sua vez usaram SSAPs para realizar suas próprias reações pretendidas - reações que permitem edições genômicas de qualquer tamanho e em qualquer local do genoma.

Uma barreira importante para a capacidade dos pesquisadores de realizar a recombinação na maioria das cepas do microbioma é o fato de que os SSAPs, como os fagos que os produzem, funcionam apenas com eficiência em uma ou em um número limitado de cepas bacterianas, e no fago apropriado. ferramentas SSAP derivadas não estão disponíveis na maioria das cepas bacterianas.

“Idealmente, gostaríamos de poder ter uma coleção de sistemas SSAP à nossa disposição, cada um para um amplo espectro de cepas bacterianas. Para atingir esse nível de ampla utilidade, queríamos primeiro entender o que torna os SSAPs eficientes ou ineficientes em uma cepa hospedeira específica ”, disse Gabriel Filsinger, co-autor de um novo estudo que investiga esse problema. “Nossa hipótese é que compreender como os SSAPs interagem com outras proteínas de ligação ao DNA durante o processo de recombinação poderia nos dizer o que limita seu uso e abre a porta para melhores sistemas de recombinação.” Filsinger trabalha como aluno de pós-graduação com o membro do corpo docente do Wyss Institute, George Church, Ph.D., na plataforma de Biologia Sintética do Instituto. Logo depois de ingressar no grupo de Church, ele se interessou em abordar a engenharia do genoma de um ângulo diferente da tecnologia CRISPR-Cas. Depois de explorar outras maneiras de criar genomas bacterianos, ele voltou sua atenção para a recombinação.

Traçando um novo caminho

Em seu estudo, que foi publicado na Nature Chemical Biology , a equipe se concentrou na bem conhecida cepa de laboratório, E. coli , bem como em um grupo de bactérias do microbioma chamadas de "bactérias láticas", que inclui cepas como Lactococcus lactis e Lactobacillus rhamnosus que têm sido usados ​​como terapêutica de microbioma de prova de princípio.

Eles primeiro desenvolveram uma abordagem in vitro que lhes permitiu investigar com quais proteínas específicas de cepas bacterianas os SSAPs de fago precisam interagir a fim de permitir que o DNA de fita simples adicionado se anule ao DNA bacteriano, que é uma etapa fundamental no processo de recombineering. O genoma bacteriano transita por um estado de fita única quando as bactérias se dividem e duplicam seu DNA. É também quando os SSAPs obtêm acesso ao DNA dos hospedeiros bacterianos e quando ocorre a recombinação.

“Descobrimos que os SSAPs requerem uma interação específica com certas proteínas bacterianas chamadas proteínas de ligação de fita única (SSBs) durante a edição do genoma, o que restringe a gama de espécies onde funcionam, uma vez que os SSBs são específicos da cepa. Nossa caracterização dessa interação fago-proteína-proteína bacteriana fornece uma estrutura para prever em quais espécies essas proteínas podem operar e torna a expansão desses métodos para novas espécies menos do que uma caixa preta ”, explicou Filsinger. Usando seus ensaios, os pesquisadores identificaram um motivo curto englobando apenas sete dos blocos de construção de aminoácidos de um SSB que decide se um SSAP particular pode se ligar a ele e permitir a recombinação. Desta forma, este motivo funciona como um código postal que varia entre as linhagens.

Além de investigar o microbioma humano, nossas descobertas podem ser relevantes para a engenharia de bactérias a serem implantadas como terapias ou diagnósticos vivos em humanos, podem ser usadas para acelerar o estudo de bactérias patogênicas humanas e devem contribuir para o avanço da engenharia microbiana em grande, fornecendo benefícios para uma série de aplicações de biologia sintética.

TIMOTHY WANNIER

Investigando seus insights sobre uma variedade de espécies bacterianas diferentes, os pesquisadores co-expressaram SSAPs com parceiros de proteína SSB compatíveis, em vez de apenas SSAPs como foi feito anteriormente. “Em várias espécies, a coexpressão de SSAP-SSB melhorou a portabilidade, resultando em maior eficiência de recombinação e toxicidade reduzida. Nosso trabalho ajuda a estabelecer a co-expressão de SSAPs com seus SSBs cognatos como um novo método que pode ser aproveitado para recombinar em diversas espécies bacterianas ”, disse o outro coautor Timothy Wannier, Ph.D., um pós-doutorado em Church's equipe.

“Além de investigar o microbioma humano, nossas descobertas podem ser relevantes para a engenharia de bactérias a serem implantadas como terapias ou diagnósticos vivos em humanos, podem ser usadas para acelerar o estudo de bactérias patogênicas humanas e devem contribuir para o avanço da engenharia microbiana em geral, proporcionando benefícios a uma série de aplicações de biologia sintética ”, acrescentou Wannier. Por exemplo, L. lactis , uma das cepas que os pesquisadores estudaram ,é amplamente utilizado na indústria de laticínios para produzir leitelho e muitos queijos e, portanto, é "geralmente considerado seguro" pelo FDA. A cepa tem potencial probiótico dentro do microbioma e foi até mesmo projetada como um veículo de entrega de proteínas terapêuticas para o tratamento de doenças inflamatórias do intestino e câncer. Os novos insights da equipe podem facilitar muito essas estratégias e ajudá-las a serem estendidas a outras espécies.

Olhando o futuro

Colocando seus resultados de recombinação em uso, Filsinger, Wannier e seus colegas de trabalho no laboratório da Igreja estão agora trabalhando em métodos de recombinação homóloga eficientes para muitas outras espécies bacterianas, identificando um catálogo de SSAPs e pares SSAP-SSB que funcionam em cada um deles. Eles também se propuseram a construir uma grande biblioteca de proteínas SSAP e as estão examinando para encontrar variantes de SSAP que funcionem de maneira otimizada em amplos grupos de espécies bacterianas.

Nosso trabalho destaca a importância dos SSBs como um nó-chave que afeta a recombinação e recombinação homóloga, e estamos muito interessados ​​em ver se novos métodos de recombinação homóloga podem ser estabelecidos por meio do aproveitamento da coordenação entre proteínas de recombinação homóloga canônica e SSBs.

GEORGE CHURCH

“Os pesquisadores tentaram por muito tempo portar proteínas de recombinação homóloga entre espécies com sucesso limitado. Isso também inclui o movimento de proteínas entre bactérias e eucariotos, como leveduras, mamíferos e plantas. Nosso trabalho destaca a importância dos SSBs como um nó-chave que afeta a recombinação e recombinação homóloga, e estamos muito interessados ​​em ver se novos métodos de recombinação homóloga podem ser estabelecidos aproveitando a coordenação entre proteínas de recombinação homóloga canônica e SSBs ”, disse Church, que também é Professor de Genética na Harvard Medical School e de Ciências da Saúde e Tecnologia em Harvard e no Massachusetts Institute of Technology (MIT).

Outros autores do estudo foram membros anteriores e atuais do laboratório da Igreja, incluindo Helene Kuchwara, Verena Volf, Stan Wang, Xavier Rios, Christopher Gregg, Marc Lajoie, Seth Shipman e John Aach; bem como Felix Pedersen na University of Southern Denmark, Odense; Isaac Lutz, da Universidade de Washington, Seattle; Julie Zhang, Kevin Gozzi e Michael Laub no MIT; Devon Stork da Universidade de Harvard; e Anik Debnath em Tenza Inc., Cambridge, MA. O trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais sob o subsídio # 1U01GM110714-01, o Departamento de Energia sob o subsídio # DE-FG02-02ER63445, os Institutos Nacionais de Saúde sob o subsídio # R01GM082899; uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da National Science Foundation sob a concessão # DGE1745303; uma bolsa Landry Cancer Biology Research.

 

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