Tecnologia Científica

Rumo a uma caixa de ferramentas para edição a  la carte do microbioma humano
Os insights de va­rus que infectam bactanãrias podem melhorar muito a edia§a£o do genoma em diversos micróbios, incluindo os do microbioma humano
Por Gabriel Filsinger e Benjamin Boettner - 23/02/2021

O número de células bacterianas dentro de cada pessoa éaproximadamente igual ao número de células humanas no corpo. Curiosamente, como essas bactanãrias contribuem para a nossa saúde ou para as doenças ainda éum grande mistanãrio. Pesquisas sobre o microbioma humano, o coletivo bacteriano que habita nosso intestino e outras partes de nosso corpo, mostraram que essas bactanãrias podem ter uma influaªncia drama¡tica em muitos aspectos da saúde humana por meio de interações com o sistema imunológico, o cérebro e durante o desenvolvimento. Para entender melhor como cepas bacterianas especa­ficas em nossos microbiomas complexos usam nutrientes específicos, produzem metaba³litos que beneficiam ou prejudicam nossos sistemas de órgãos e interagem entre si e com assuperfÍcies do corpo, bia³logos sintanãticos estãotentando identificar os elementos genanãticos responsa¡veis ​​em seus genomas e descobrir como eles contribuem para as diferenças entre pessoas sauda¡veis ​​e pessoas com doena§as. Para fazer isso sistematicamente, eles gostariam de ser capazes de editar precisamente os genomas bacterianos em posições especa­ficas em uma ampla variedade de cepas.

Engenharia de microbioma: limites e oportunidades

Rumo a uma caixa de ferramentas para edição a  la carte do microbioma humano
Bia³logos sintanãticos do Wyss Institute obtiveram percepções cra­ticas sobre o que limita o uso de um manãtodo de engenharia de genoma conhecido como “recombineering” em estudos do microbioma humano e sua manipulação, e abre um caminho para uma caixa de ferramentas de engenharia abrangente. Crédito: KJFalkenberg

A quase onipresente ferramenta de edição do genoma CRISPR-Cas tem sido desafiadora para uso amplamente no reino bacteriano, uma vez que a enzima Cas9 mata a maioria das bactanãrias, em vez de estimular a edição do genoma. Os pesquisadores atuais do microbioma são forçados a recorrer a outras técnicas, incluindo “recombineering” (engenharia genanãtica mediada por recombinação) como manãtodo de escolha. A recombinação permite a edição precisa de sequaªncias de DNA em cromossomos bacterianos sem danifica¡-los (não hácortes ou quebras de DNA e as edições não apresentam cicatrizes). As ferramentas de recombinação atuais são emprestadas de va­rus bacterianos chamados bacteria³fagos (ou fagos) que se especializam em um pequeno número de cepas bacterianas, mas não podem infectar outras. Os fagos usam suas chamadas "protea­nas de anelamento de DNA de fita simples" (SSAPs) para replicar e recombinar seus genomas dentro dessas bactanãrias. Isso forneceu uma oportunidade para os pesquisadores, que por sua vez usaram SSAPs para realizar suas próprias reações pretendidas - reações que permitem edições gena´micas de qualquer tamanho e em qualquer local do genoma.

Uma barreira importante para a capacidade dos pesquisadores de realizar a recombinação na maioria das cepas do microbioma éo fato de que os SSAPs, como os fagos que os produzem, funcionam apenas com eficiência em uma ou em um número limitado de cepas bacterianas, e no fago apropriado. ferramentas SSAP derivadas não estãodisponí­veis na maioria das cepas bacterianas.

“Idealmente, gostara­amos de poder ter uma coleção de sistemas SSAP a  nossa disposição, cada um para um amplo espectro de cepas bacterianas. Para atingir essenívelde ampla utilidade, quera­amos primeiro entender o que torna os SSAPs eficientes ou ineficientes em uma cepa hospedeira especa­fica ”, disse Gabriel Filsinger, co-autor de um novo estudo que investiga esse problema. “Nossa hipa³tese éque compreender como os SSAPs interagem com outras protea­nas de ligação ao DNA durante o processo de recombinação poderia nos dizer o que limita seu uso e abre a porta para melhores sistemas de recombinação.” Filsinger trabalha como aluno de pós-graduação com o membro do corpo docente do Wyss Institute, George Church, Ph.D., na plataforma de Biologia Sintanãtica do Instituto. Logo depois de ingressar no grupo de Church, ele se interessou em abordar a engenharia do genoma de um a¢ngulo diferente da tecnologia CRISPR-Cas. Depois de explorar outras maneiras de criar genomas bacterianos, ele voltou sua atenção para a recombinação.

Trabalhando um novo caminho

Em seu estudo, que foi publicado na Nature Chemical Biology , a equipe se concentrou na bem conhecida cepa de laboratório, E. coli , bem como em um grupo de bactanãrias do microbioma chamadas de "bactanãrias la¡ticas", que inclui cepas como Lactococcus lactis e Lactobacillus rhamnosus que tem sido usados ​​como terapaªutica de microbioma de prova de princa­pio.

Eles primeiro desenvolveram uma abordagem in vitro que lhes permitiu investigar com quais protea­nas especa­ficas de cepas bacterianas os SSAPs de fago precisam interagir a fim de permitir que o DNA de fita simples adicionado se anule ao DNA bacteriano, que éuma etapa fundamental no processo de recombineering. O genoma bacteriano transita por um estado de fita única quando as bactanãrias se dividem e duplicam seu DNA. a‰ também quando os SSAPs obtem acesso ao DNA dos hospedeiros bacterianos e quando ocorre a recombinação.

“Descobrimos que os SSAPs requerem uma interação especa­fica com certas protea­nas bacterianas chamadas protea­nas de ligação de fita única (SSBs) durante a edição do genoma, o que restringe a gama de espanãcies onde funcionam, uma vez que os SSBs são específicos da cepa. Nossa caracterização dessa interação fago-protea­na-protea­na bacteriana fornece uma estrutura para prever em quais espanãcies essas protea­nas podem operar e torna a expansão desses manãtodos para novas espanãcies menos do que uma caixa preta ”, explicou Filsinger. Usando seus ensaios, os pesquisadores identificaram um motivo curto englobando apenas sete dos blocos de construção de aminoa¡cidos de um SSB que decide se um SSAP particular pode se ligar a ele e permitir a recombinação. Desta forma, este motivo funciona como um ca³digo postal que varia entre as linhagens.

Além de investigar o microbioma humano, nossas descobertas podem ser relevantes para a engenharia de bactanãrias a serem implantadas como terapias ou diagnósticos vivos em humanos, podem ser usadas para acelerar o estudo de bactanãrias patogaªnicas humanas e devem contribuir para o avanço da engenharia microbiana em grande, fornecendo benefa­cios para uma sanãrie de aplicações de biologia sintanãtica.

TIMOTHY WANNIER

Investigando seus insights sobre uma variedade de espanãcies bacterianas diferentes, os pesquisadores co-expressaram SSAPs com parceiros de protea­na SSB compata­veis, em vez de apenas SSAPs como foi feito anteriormente. “Em várias espanãcies, a coexpressão de SSAP-SSB melhorou a portabilidade, resultando em maior eficiência de recombinação e toxicidade reduzida. Nosso trabalho ajuda a estabelecer a co-expressão de SSAPs com seus SSBs cognatos como um novo manãtodo que pode ser aproveitado para recombinar em diversas espanãcies bacterianas ”, disse o outro coautor Timothy Wannier, Ph.D., um pa³s-doutorado em Church's equipe.

“Além de investigar o microbioma humano, nossas descobertas podem ser relevantes para a engenharia de bactanãrias a serem implantadas como terapias ou diagnósticos vivos em humanos, podem ser usadas para acelerar o estudo de bactanãrias patogaªnicas humanas e devem contribuir para o avanço da engenharia microbiana em geral, proporcionando benefa­cios a uma sanãrie de aplicações de biologia sintanãtica ”, acrescentou Wannier. Por exemplo, L. lactis , uma das cepas que os pesquisadores estudaram ,éamplamente utilizado na indústria de latica­nios para produzir leitelho e muitos queijos e, portanto, é"geralmente considerado seguro" pelo FDA. A cepa tem potencial probia³tico dentro do microbioma e foi atémesmo projetada como um vea­culo de entrega de protea­nas terapaªuticas para o tratamento de doenças inflamata³rias do intestino e ca¢ncer. Os novos insights da equipe podem facilitar muito essas estratanãgias e ajuda¡-las a serem estendidas a outras espanãcies.

Olhando o futuro

Colocando seus resultados de recombinação em uso, Filsinger, Wannier e seus colegas de trabalho no laboratório da Igreja estãoagora trabalhando em manãtodos de recombinação homa³loga eficientes para muitas outras espanãcies bacterianas, identificando um cata¡logo de SSAPs e pares SSAP-SSB que funcionam em cada um deles. Eles também se propuseram a construir uma grande biblioteca de protea­nas SSAP e as estãoexaminando para encontrar variantes de SSAP que funcionem de maneira otimizada em amplos grupos de espanãcies bacterianas.

Nosso trabalho destaca a importa¢ncia dos SSBs como um na³-chave que afeta a recombinação e recombinação homa³loga, e estamos muito interessados ​​em ver se novos manãtodos de recombinação homa³loga podem ser estabelecidos por meio do aproveitamento da coordenação entre protea­nas de recombinação homa³loga cana´nica e SSBs.

GEORGE CHURCH

“Os pesquisadores tentaram por muito tempo portar protea­nas de recombinação homa³loga entre espanãcies com sucesso limitado. Isso também inclui o movimento de protea­nas entre bactanãrias e eucariotos, como leveduras, mama­feros e plantas. Nosso trabalho destaca a importa¢ncia dos SSBs como um na³-chave que afeta a recombinação e recombinação homa³loga, e estamos muito interessados ​​em ver se novos manãtodos de recombinação homa³loga podem ser estabelecidos aproveitando a coordenação entre protea­nas de recombinação homa³loga cana´nica e SSBs ”, disse Church, que também éProfessor de Genanãtica na Harvard Medical School e de Ciências da Saúde e Tecnologia em Harvard e no Massachusetts Institute of Technology (MIT).

Outros autores do estudo foram membros anteriores e atuais do laboratório da Igreja, incluindo Helene Kuchwara, Verena Volf, Stan Wang, Xavier Rios, Christopher Gregg, Marc Lajoie, Seth Shipman e John Aach; bem como Felix Pedersen na University of Southern Denmark, Odense; Isaac Lutz, da Universidade de Washington, Seattle; Julie Zhang, Kevin Gozzi e Michael Laub no MIT; Devon Stork da Universidade de Harvard; e Anik Debnath em Tenza Inc., Cambridge, MA. O trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Ciências Manãdicas Gerais sob o subsa­dio # 1U01GM110714-01, o Departamento de Energia sob o subsa­dio # DE-FG02-02ER63445, os Institutos Nacionais de Saúde sob o subsa­dio # R01GM082899; uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da National Science Foundation sob a concessão # DGE1745303; uma bolsa Landry Cancer Biology Research.

 

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