A terapia genética promete prevenir e curar doenças através da manipulação da expressão gênica nas células do paciente. No entanto, para ser eficaz, o novo gene precisa chegar ao núcleo da célula. A incapacidade de fazer isso de forma consistente e eficiente tem dificultado o avanço do tratamento.

Pesquisadores da Universidade da Califórnia em San Diego, liderados pelo laboratório do professor Neal Devaraj, do Departamento de Bioquímica e Biofísica Molecular, revelaram um novo método que aumenta consideravelmente a eficácia da transferência de genes, minimizando os efeitos colaterais nocivos para a célula. O trabalho foi publicado na revista Nature Communications .

Para que as terapias genéticas sejam eficazes, o gene introduzido deve ser entregue às células-alvo, movendo-se, em última instância, do citoplasma para o núcleo. Embora a entrega de genes no citoplasma seja bem conhecida e padronizada, levar os genes do citoplasma para o núcleo pode ser bastante desafiador.

Para compensar a baixa eficiência de translocação nuclear (estimada em cerca de 1%), as potenciais terapias genéticas podem exigir doses muito elevadas de DNA para garantir que uma quantidade adequada chegue ao núcleo. Essas altas doses podem desencadear respostas imunes e citotoxicidade.

A introdução do DNA no núcleo pode ser feita utilizando sinais de localização nuclear (NLS, na sigla em inglês) — pequenas sequências peptídicas que atuam como códigos de correio molecular, marcando certas proteínas para o transporte até o núcleo. A ligação do DNA ao NLS permite que ele seja transportado para o núcleo. Embora esse método esteja em desenvolvimento há várias décadas, os resultados obtidos até agora têm sido inconsistentes e difíceis de reproduzir.

Essa metodologia enfrentou diversos desafios, sendo o maior deles o fato de que, até então, a química não estava suficientemente desenvolvida para permitir que os cientistas observassem e compreendessem de fato o que acontece durante a entrega nuclear do NLS ao DNA. O comprimento do NLS importa? O espaço entre o NLS e o DNA importa? Os pesquisadores estão usando a sequência de NLS errada? Deveriam anexar múltiplos NLS ao DNA?

O que era necessário era uma maneira de analisar todas essas variáveis para que os pesquisadores pudessem identificar facilmente quais permutações apresentavam os melhores resultados. Foi exatamente isso que o laboratório de Devaraj criou ao desenvolver um fluxo de trabalho químico que permite analisar facilmente conjugados de DNA-NLS, possibilitando aos usuários definir os parâmetros das conjugações.

"Ao criar esse fluxo de trabalho, conseguimos realizar triagens robustas, definindo essencialmente as regras de design que permitem anexar um desses peptídeos NLS a um cassete de gene de DNA. Observamos um aumento de mais de dez vezes na entrega de DNA nuclear", afirmou Zulfiqar Mohamedshah, estudante de pós-graduação em bioquímica e primeiro autor do artigo.

O novo fluxo de trabalho foi adaptado de uma tecnologia de marcação enzimática de DNA, DNA-TAG , desenvolvida anteriormente no Laboratório Devaraj. Neste trabalho, a equipe utilizou uma enzima derivada de bactérias, a TGT (tRNA guanina transglicosilase), para modificar o DNA com um marcador químico que permite a posterior e fácil ligação de peptídeos ao DNA, incluindo peptídeos NLS.

Com esse fluxo de trabalho, o laboratório conseguiu modificar cassetes de genes de DNA — fragmentos móveis de DNA — com peptídeos NLS e, em seguida, alterar os parâmetros do NLS: o tipo de NLS usado, o espaço entre o NLS e o DNA e o número de NLS ligados ao DNA. A cassete de gene foi codificada com um repórter eGFP que emite fluorescência verde em células humanas após a introdução e expressão no núcleo.

Dessa forma, eles conseguiram analisar diferentes permutações de conjugados de DNA-NLS para verificar quais combinações eram mais eficazes na penetração do núcleo. Esse novo fluxo de trabalho de triagem permite que os pesquisadores definam e utilizem com precisão os conjugados de DNA-NLS com maior capacidade de entrega nuclear.

"Conseguimos obter uma expressão do DNA direcionado ao núcleo dez vezes maior do que a expressão do DNA não modificado", afirmou Devaraj, um dos coautores do artigo e chefe do departamento de bioquímica. "Isso significa que é possível fornecer menos DNA à célula e ainda assim aumentar a expressão, o que deve mitigar problemas de citotoxicidade."

O objetivo final de qualquer terapia gênica é curar pacientes doentes, então, para testar seu fluxo de trabalho, a equipe introduziu um cassete gênico codificando o Fator IX, uma proteína deficiente na doença de Christmas, um distúrbio hemorrágico hereditário raro. Os resultados mostraram uma expressão do Fator IX 10 vezes maior do que nos controles, destacando o potencial dos conjugados de DNA-NLS para aplicações de terapia gênica não viral.

Este artigo também é um dos primeiros a demonstrar que sequências específicas de DNA-NLS funcionam melhor em tipos de tecido específicos: o tecido hepático apresentou peptídeos NLS específicos que se mostraram mais eficazes na translocação nuclear do que quando utilizados em tecido cardíaco ou renal. Pesquisas futuras poderão elucidar com que precisão esses conjugados de DNA-NLS podem ser utilizados para a entrega em tecidos específicos.

A equipe gostaria de estudar mais a fundo se a administração de conjugados de DNA-NLS às células diminui a resposta imune — outro obstáculo nesse tipo de terapia gênica. Eles também estão investigando o uso do fluxo de trabalho para potencializar as edições de DNA genômico usando CRISPR-Cas-9 e esperam continuar aprimorando-o para torná-lo mais clinicamente aplicável e escalável, aproximando-o do leito do paciente.