Amedida que os Estados Unidos correm para acelerar os testes para o coronava­rus pandaªmico usando a tecnologia baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR), tentativas e verdadeiras comea§am a surgir abordagens alternativas que poderiam tornar mais fa¡cil e rápido para as pessoas saberem se elas foram infectados. Alguns manãtodos modificam o teste padrãode PCR, que amplifica pequenos pedaço s de material genanãtico para permitir a detecção, enquanto outros sequenciam o va­rus diretamente ou usam o editor de genoma CRISPR.

Testes mais rápidos e baratos estãochegando, diz Evan Jones, CEO da OpGen, uma empresa de diagnóstico rápido em Gaithersburg, Maryland. No entanto, ele acrescenta, o desenvolvimento de novos tipos de testes "levara¡ tempo". Alguns dos novos testes estãoentrando online agora, mas outros provavelmente levara£o meses para serem validados e prontos para ampla distribuição.

“Testar, testar, testar” foi o mantra repetido várias vezes pelo diretor-geral da OMS, Tedros Adhanom Ghebreyesus. Os testes de diagnóstico que identificam infecções ativas nas pessoas são de vital importa¢ncia para os esforços de saúde pública, não apenas para os problemas de saúde dos indiva­duos. Testes de diagnóstico generalizados, juntamente com o isolamento dos infectados, o rastreamento de contatos e a quarentena desses contatos, parecem ter sido fundamentais no trabalho da Coranãia do Sul para suprimir a disseminação de va­rus.

Nos Estados Unidos, a lenta implantação dos testes de PCR para coronava­rusfoi amplamente atribua­do a uma combinação de regras rigorosas destinadas a garantir sua confiabilidade e a uma complexa rede de empresas e sistemas de saúde responsa¡veis ​​pelo desenvolvimento, execução e pagamento de testes. O governo Trump diz que os testes estãose acelerando. Na semana passada, em uma entrevista coletiva na Casa Branca, o secreta¡rio-assistente de Saúde e Servia§os Humanos dos EUA, Almirante Brett Giroir, disse que opaís seria capaz de processar 1 milha£o de testes atéo final da semana e 2 milhões na semana seguinte. Mas os números reais ainda não estãopra³ximos disso. De acordo com dados compilados pelo COVID Tracking Project, uma colaboração sem fins lucrativos de autoridades de saúde pública e jornalistas que contam testes realizados nos Estados Unidos, 191.541 diagnósticos por PCR foram realizados em 22 de mara§o, dos quais 24.345 positivos para o va­rus.

Em 29 de fevereiro, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA publicou novas regras para permitir autorizações de uso emergencial de testes de coronava­rus além daqueles que estãosendo feitos e distribua­dos pelo Centro de Controle e Prevenção de Doena§as (CDC). Laborata³rios acadaªmicos de virologia, departamentos de saúde pública e empresas começam a trabalhar criando seus pra³prios testes de PCR. Hoje, cerca de quatro daºzias de organizações receberam a aprovação do FDA para seus testes. Entre as maiores estãoempresas de diagnóstico, como a Roche Molecular Systems, que recebeu o sinal verde do FDA para seu teste esta semana. Inicialmente, fornecera¡ cerca de 400.000 testes por semana nos Estados Unidos e 3 milhões em todo o mundo, de acordo com Alexandra Valsamakis, diretora médica da empresa. Outras grandes empresas recentemente também obtiveram aprovação para seus testes, incluindo Thermo Fisher e Abbott.

Os laboratórios de virologia da universidade também entraram na brecha para ajudar a diagnosticar casos nas proximidades. Na semana passada, por exemplo, os médicos do Centro Manãdico da Universidade de Pittsburgh começam a usar um teste de PCR caseiro para verificar a infecção no Condado de Allegheny. Por enquanto, seu número de testes permanece pequeno, cerca de 100 por semana. "Definitivamente, desejamos ter comea§ado mais cedo", diz Alan Wells, que dirige os laboratórios clínicos da UPMC.

A PCR éo teste mais usado para diagnosticar o coronava­rus porque éaltamente preciso. (Consulte Como o teste de coronava­rus mais comum funciona? ) Mas outros problemas o limitam. "Nãoestãoobtendo a resposta necessa¡ria", diz Steven Wolinsky, médico de doenças infecciosas da Universidade Northwestern. Cada teste leva cerca de 4 horas após a amostra chegar a um laboratório de testes centralizado, com o tempo dividido entre a preparação da amostra e o teste de PCR real. Com o transporte e as filas, a obtenção de um resultado pode levar de 2 a 4 dias. Nesse período, as pessoas infectadas podem espalhar o va­rus para muitos outros.

Outra nova dimensão estãosendo adicionada ao cena¡rio de diagnóstico de coronava­rus: testes "em casa", que envolvem o envio de uma amostra colhida em casa para um laboratório. Amanha£, por exemplo, a Everlywell espera comea§ar a enviar kits para residaªncias e farma¡cias. Esses testes comea§ara£o com perguntas de triagem, on-line ou em um varejista, para determinar se éprova¡vel que uma pessoa tenha sido exposta ao va­rus. Se estiverem, eles podem receber um kit de amostragem nasofara­ngeo por correio ou podem comprar um de um revendedor local. Uma pessoa recebera¡ instruções detalhadas para administrar seu pra³prio swab, inseri-lo em um frasco protetor e envia¡-lo durante a noite para um dos dezenas de laboratórios de diagnóstico (que se associaram a  Everlywell e já tem aprovação da FDA) para análise de PCR.

Frank Ong, diretor médico e cienta­fico da Everlywell, diz que a empresa espera aumentar rapidamente, oferecendo milhares de testes por dia a dezenas de milhares. Embora cada teste ainda exija uma espera de quatro dias pelos resultados, diz Ong, essa estratanãgia de amostragem em casa traz grandes benefa­cios: ela protege os profissionais de saúde da exposição a infecções em potencial e libera seu tempo. “Precisamos garantir que eles tenham a largura de banda para cuidar dos pacientes”, diz Ong. Outras empresas, incluindo a Nurx e a Carbon Health, dizem que agora estãoentregando suprimentos limitados de seus pra³prios kits de amostragem em casa.

A maioria dos testes de PCR para o novo va­rus estãosendo feita com ma¡quinas automatizadas grandes e caras que fazem muitos testes ao mesmo tempo. Os principais hospitais ou instalações de diagnóstico os possuem, mas outra opção que comea§a a ser implantada agora édispositivos menores e mais baratos que também fazem amplificação de a¡cidos nuclanãicos. Estes poderiam ser usados ​​por hospitais menores e atépor consulta³rios médicos individuais.

Na sexta-feira, por exemplo, a Cepheid, que vende pequenos sistemas de PCR para detectar rapidamente va­rus da gripe, bactanãrias da tuberculose e outros micróbios, recebeu aprovação de uso emergencial da FDA para um cartucho de teste SARS-CoV2 que se encaixa no sistema GenXpert da empresa, um dispositivo do tamanho ma¡quina de caféexpresso que pode produzir um resultado diagnóstico em menos de 45 minutos. Funciona¡rios da Cepheid dizem que 23.000 desses sistemas estãoem vigor em todo o mundo, com 5.000 nos Estados Unidos. Na semana passada, o GenMark recebeu a aprovação de uso de emergaªncia da FDA para seus pra³prios testes de coronava­rus, que são executados em ma¡quinas de tamanho semelhante, que usam uma abordagem eletroquímica proprieta¡ria para detectar material genanãtico alvo em menos de 2 horas. Outras empresas que correm para entregar ma¡quinas de diagnóstico de ponto de atendimento incluem a Mesa Biotech, HiberGene, Mobidiag e QuantuMDx.

O mesmo acontece com empresas como a Oxford Nanopore e a Fulgent Genetics, que, em vez de usar a PCR, sequenciam diretamente qualquer material genanãtico de uma amostra e depois procuram correspondaªncias para, digamos, o novo coronava­rus. Essa abordagem de sequenciamento genanãtico de alta velocidade pode ajudar a caracterizar o genoma do coronava­rus para entender melhor como o va­rus estãoevoluindo , mas também pode ser um diagnóstico em determinadas situações, como locais remotos sem acesso a  PCR. Os dispositivos porta¡teis da Oxford Nanopore foram usados ​​em surtos de Ebola, e a empresa enviou muitos para a China no ini­cio da pandemia.

A maneira mais rápida de testar o coronava­rus pode ser oferecida por empresas que usam o editor de genoma CRISPR, mais conhecido por adicionar ou excluir DNA nas células. Duas empresas americanas, Mammoth Biosciences e Sherlock Biosciences, dizem que criaram testes baseados no CRISPR e estãono processo de valida¡-los com amostras de pacientes antes de buscar a aprovação de uso emergencial pelo FDA. A técnica comea§a com uma amostra do paciente, extrai o RNA viral e usa um teste rápido de amplificação de a¡cido nucleico chamado amplificação mediada por loop para produzir RNA suficiente para o teste detectar. Os pesquisadores adicionam dois componentes de um editor de genoma do CRISPR, uma protea­na chamada CAS12 que corta DNA ou RNA e um RNA "guia" que se encaixa no CAS12 e ajuda a pesquisar uma sequaªncia correspondente a um pedaço do genoma do coronava­rus. Se o CAS12 e seu guia encontrarem uma correspondaªncia no RNA, o CAS12 se ligara¡ ao RNA correspondente, que ativa o CAS12 para corta¡-lo e depois corta quaisquer outras fitas curtas de RNA ou DNA nas proximidades, incluindo ca³pias de uma fita projetada para liberar cor mudando moléculas quando o CAS12 as liberta. O resultado pode ser uma simples mudança de cor em uma tira de teste.

A técnica éexcelente na busca de pequenos fragmentos de material genanãtico, diz Jennifer Doudna, bioquímica da Universidade da Califa³rnia, Berkeley, pioneira do CRISPR, que épresidente do conselho consultivo de ciências da Mammoth Bioscience.

Em uma pré-impressão publicada em 10 de mara§o no medRxiv, pesquisadores da Mammoth Biosciences e da Universidade da Califa³rnia, em San Francisco, relatam que testes em amostras cla­nicas produziram resultados com taxas de precisão compara¡veis a  PCR em apenas 30 minutos. Ele usa uma simples tira semelhante a papel com uma linha colorida que aparece com um resultado positivo. A empresa estãodiscutindo com os parceiros a fabricação de kits de teste que permitiriam o diagnóstico rápido e barato da infecção por SARS-CoV2 em casa, sem a necessidade de conhecimento médico, diz Trevor Martin, CEO da Mammoth.

Pode levar meses para finalizar o teste e obter aprovação regulata³ria, portanto, provavelmente não estara¡ pronto nas próximas semanas cruciais. Mas poderia estar pronto se a disseminação do coronava­rus continuar. Alguns prevaªem que o va­rus também ira¡ recuar, mas depois ressurgira£o de infecções no outono. Obter resultados não exigiria ma¡quinas de PCR operadas por técnicos treinados, diz Martin. "Seria um divisor de a¡guas para a nossa resposta" a s doenças emergentes, diz Martin.

Mesmo quando empresas e laboratórios acadaªmicos estãoampliando seus esforços de diagnóstico baseados em PCR, hospitais e locais de testes em todo opaís relatam que estãoenfrentando uma crise mais imediata: muitos estãoficando sem produtos químicos e outros materiais que permitem os testes, como o swabs para coletar amostras de pacientes e reagentes necessa¡rios para a PCR. Benjamin Pinsky, patologista da Universidade de Stanford que desenvolveu um teste de diagnóstico baseado em PCR em uso no norte da Califa³rnia, diz que seu laboratório estãoenfrentando escassez de diferentes suprimentos, principalmente os kits usados ​​para extrair o RNA de amostras virais, antes que ele possa ser carregado no Ma¡quinas de PCR.

"Este tem sido um grande desafio", diz Pinsky. "Tivemos que ser muito a¡geis ao lidar com isso", constantemente trocando de fornecedor ou mesmo procedimentos qua­micos, que devem ser validados antes que possam ser usados ​​em amostras de pacientes. Sua equipe atéenviou pedidos pelo Twitter para a comunidade de Stanford e empresas regionais de biotecnologia pedindo doações de conjuntos de reagentes, como kits da Zymo e Qiagen. E mesmo que as doações tenham chegado, os suprimentos ainda estãoacabando, diz Pinsky.

As empresas reagentes estãotentando responder. Por exemplo, a Qiagen, uma importante fornecedora de kits de extração de RNA, anunciou na tera§a-feira que seus funciona¡rios estãotrabalhando dia e noite para aumentar a produção de 1,5 milha£o de kits por maªs para 6,5 ​​milhões por maªs atéo final de abril e aumentos adicionais posteriormente.

Pinsky, por exemplo, diz que estãopronto para as empresas assumirem os testes de coronava­rus inteiramente de acadaªmicos como ele. "Espero que essas empresas possam fornecer os testes que prometeram", diz Pinsky. "Isso ainda precisa ser visto".

Por Robert F. Service

Para diagnosticar o SARS-CoV-2, um teste de PCR comea§a com uma zaragatoa nasofara­ngea, que se parece com uma ponta Q longa que extrai muco da parte traseira da cavidade nasal do paciente, onde encontra a garganta. Este swab entra em um frasco e éenviado para uma instalação de laboratório central aprovada pela FDA. La¡, os técnicos usam reagentes para extrair qualquer RNA viral. Uma enzima chamada transcriptase reversa converte o RNA em uma sequaªncia complementar de DNA, que pode ser replicada várias vezes para facilitar a detecção. Para realizar essa replicação e detecção, os técnicos - ou ma¡quinas automatizadas, na maioria dos casos - adicionam reagentes adicionais que incluem um par de "primers" que contem ca³pias de pedaço s de DNA correspondentes ao ca³digo genanãtico do va­rus, uma enzima de ca³pia de DNA chamada polimerase,

Uma ma¡quina de PCR aumenta a temperatura, fazendo com que os dois filamentos de hanãlices de DNA se separem em filamentos aºnicos. A temperatura éentão reduzida, permitindo que os iniciadores e os fios repa³rter se liguem a s sequaªncias correspondentes nos fios simples. A temperatura éentão aumentada para umnívelintermediário, incentivando a enzima polimerase a se trancar onde um primer se liga a uma fita de DNA. A enzima se move ao longo da fita, adicionando nucleota­deos complementares atéque a fita seja copiada. Quando a polimerase atinge a sequaªncia repa³rter, uma sonda fluorescente éliberada, criando um sinal a³ptico de que a fita foi copiada.

O ciclo se repete, transformando dois fios-alvo em quatro, depois oito, e assim por diante. Apa³s cerca de quarenta ciclos, existem cerca de 100 bilhaµes de ca³pias do DNA alvo e um sinal fluorescente facilmente detecta¡vel. "A PCR tem alta sensibilidade e seletividade", o que significa que identifica corretamente quase todos os casos positivos e descarta corretamente quase todos os casos não infectados, diz Steven Wolinsky, médico de doenças infecciosas da Northwestern University. "Isso faz da PCR um teste de diagnóstico realmente bom".