O Cryo-EM requer que as amostras de protea­nas sejam congeladas antes de serem fotografadas usando um microsca³pio eletra´nico. Essa técnica revoluciona¡ria e sua aplicação a  biologia estrutural foi o foco do Praªmio Nobel de Quí­mica em 2017 e contribuiu para uma onda de novas informações estruturais para protea­nas que eram difa­ceis ou impossa­veis de preparar para cristalografia de raios-X. Amedida que o crio-EM se tornou mais popular, surgiram novos manãtodos e ferramentas para melhorar a técnica e torna¡-la mais eficiente. Agora, muitas pessoas estãotrabalhando na maneira como as amostras são preparadas para que seja mais fa¡cil obter informações estruturais de alta resolução de cada experimento. Uma vez que as amostras são preparadas, háuma sanãrie de ferramentas automatizadas que foram desenvolvidas para coletar aspartículas congeladas a serem processadas. Foi enquanto investigava essas ferramentas que Ph.D. O estudante Mateusz Olek e seu supervisor Peijun Zhang, com a ajuda de Yuriy Chaban e Donovan Webb, descobriram um problema incomum. Suas descobertas foram publicadas na revistaEstrutura .

Os coletores departículas automatizados são projetados para analisar uma imagem e escolher automaticamente as melhorespartículas a serem selecionadas para experimentos. Ao estudar o desempenho dessas ferramentas, a equipe percebeu que havia partes da imagem sem seleções. Esses vazios não foram facilmente explicados, especialmente quando a equipe inspecionou visualmente as imagens e viu claramente que aspartículas estavam presentes. Por alguma raza£o, os coletores departículas automatizados eram cegos para certas regiaµes da imagem. Este problema pode ter repercussaµes para experimentos crio-EM. Separtículas via¡veis ​​estãosendo deixadas para trás pelo software de automação, os cientistas podem não conseguir coletar todos os dados de que precisam para um experimento.

A equipe rapidamente percebeu que o plano de fundo das imagens não era consistente. Algumas porções eram mais escuras e outras mais claras. Isso pode explicar algumas das falhas no software de automação que dependem da medição do contraste de uma parta­cula de protea­na contra o fundo. Para fazer crio-EM,partículas de protea­na são suspensas em uma fina pela­cula de gelo, então a equipe concluiu que as inconsistaªncias no fundo da imagem estavam relacionadas a diferentes espessuras do gelo. Isso levantou vários problemas para os pesquisadores que usam crio-EM. Em primeiro lugar, uma solução a³bvia seria tentar tornar o filme de gelo mais uniforme. Infelizmente, enquanto grandes esforços estãosendo feitos para melhorar a preparação de amostras crio-EM, ainda émuito difa­cil gerar um filme uniforme de gelo. Muitas vezes, um gradiente de espessura de gelo pode ser visto em uma amostra crio-EM.

Mateusz e a equipe começam do zero a desenvolver um novo manãtodo para combater o problema do gelo. Eles começam segmentando diferentes imagens e analisando o fundo. Isso permitiu que seu selecionador identificassepartículas independentemente do fundo proveniente do gelo. Essa inovação significava que, em um determinado experimento, os pesquisadores agora poderiam coletar mais informações estruturais de maneira confia¡vel analisando maispartículas de protea­na. No entanto, este não foi o fim da estrada. Embora coletar maispartículas seja extremamente valioso para pesquisadores que usam crio-EM, a quantidade de gelo afeta a qualidade daspartículas e, portanto, a qualidade dos mapas crio-EM que podem ser reconstrua­dos. Mateusz e a equipe de pesquisa sabiam que poderiam levar o software adiante,

Em sua recente publicação, a equipe de pesquisa destacou dois grandes problemas que podem surgir quando o gelo não tem a espessura ideal. Em primeiro lugar, gelo muito espesso cria mais rua­do de fundo na imagem. Isso dificulta a obtenção de dados de alta resolução de uma parta­cula de protea­na. Por outro lado, se o filme de gelo for muito fino, pode não suportar as protea­nas adequadamente. Este problema émuito dependente das protea­nas especa­ficas que um pesquisador estãoinvestigando. Por exemplo, algumas protea­nas são pequenas e fortemente ligadas em uma configuração esfanãrica. Essas protea­nas podem ser suportadas em camadas relativamente finas de gelo. No entanto, muitas protea­nas são grandes com longos ramos salientes que podem cair fora do filme de gelo se for muito fino. Isso significa que o gelo fino dificulta a imagem desses tipos de protea­nas, mesmo que o rua­do de fundo seja muito baixo. A espessura ideal do gelo éalgo que minimiza o fundo, mas éespesso o suficiente para suportar totalmente a protea­na. Muitas vezes, a espessura ideal do gelo dependera¡ da natureza doprotea­na que estãosendo estudada e mudara¡ dependendo do experimento.

Sua nova ferramenta de software, IceBreaker, poderia automatizar completamente a seleção de partículas No entanto, a equipe optou por uma abordagem que da¡ mais flexibilidade aos pesquisadores que a utilizam. Em vez de tomar decisaµes, o software anota cada parta­cula dando ao pesquisador uma indicação da qualidade. Isso permite que eles conduzam seus experimentos exatamente da maneira que precisam para alcana§ar os melhores resultados. a€s vezes, menospartículas de alta qualidade são suficientes e, a s vezes, são necessa¡rias maispartículas de qualidade inferior de gelo mais espesso para mostrar orientações departículas únicas não suportadas pelo gelo fino. Usando o novo software IceBreaker, os pesquisadores estãono controle total dos dados que estãocoletando. IcreBreaker agora estãosendo implementado como parte do pipeline de coleta de dados na Diamond's Electron Bio-Imaging Center (eBIC) e estãodispona­vel gratuitamente no GitHub.