Uma equipe do Departamento de Ortopedia, Reumatologia e Ciências Musculoesqueléticas (NDORMS) de Nuffield, em Oxford, desenvolveu uma nova abordagem para melhorar significativamente a precisão do sequenciamento de RNA. Eles identificam a fonte primária de quantificação imprecisa no sequenciamento de RNA de leitura curta e longa e introduziram o conceito de correção de erros por 'voto majoritário', levando a uma melhoria substancial na contagem molecular de RNA.

O sequenciamento preciso do material genético é crucial na biologia moderna, particularmente para compreender e abordar doenças ligadas a anomalias genéticas. No entanto, as metodologias atuais encontram restrições substanciais. Em um estudo marcante , um consórcio internacional de pesquisadores, liderado por Adam Cribbs, Professor Associado em Biologia Computacional , e Jianfeng Sun , Pesquisador Associado de Pós-Doutorado no Instituto Botnar , Universidade de Oxford, desenvolveram um método inovador para corrigir erros na amplificação por PCR – uma técnica amplamente utilizada em sequenciamento de alto rendimento. Ao identificar artefatos de PCR como a principal fonte de quantificação imprecisa, a pesquisa, publicada na Nature Methods, aborda um desafio de longa data na geração de contagens absolutas precisas de moléculas de RNA, o que é crucial para diversas aplicações na pesquisa genômica.

Os pesquisadores se concentraram em Identificadores Moleculares Únicos (UMIs), que são sequências oligonucleotídicas aleatórias usadas para remover vieses introduzidos durante a amplificação por PCR. Embora os UMIs tenham sido amplamente adotados em métodos de sequenciamento, o estudo revela que os erros de PCR podem prejudicar a precisão da quantificação molecular, particularmente em diferentes plataformas de sequenciamento.

Jianfeng explicou: 'A amplificação por PCR, essencial para a maioria das técnicas de sequenciamento de RNA, pode introduzir erros, comprometendo a integridade dos dados. Resolvemos isso sintetizando códigos de barras UMI usando blocos de nucleotídeos homotrímeros, melhorando a correção de erros e permitindo a quantificação quase absoluta da molécula de RNA, melhorando significativamente a precisão da contagem molecular.

Homotrímeros são sequências de nucleotídeos que consistem em três bases idênticas, por exemplo AAA, CCC, GGG. Ao avaliar a similaridade de nucleotídeos dos homotrímeros, os erros são detectados e corrigidos através de um método de "votação majoritária" (Figura 1).

O estudo demonstra que os UMIs de homotrímeros superam significativamente os UMIs de monômeros tradicionais na redução do enriquecimento de dobras falso-positivas durante a análise de genes e transcritos diferencialmente expressos (DEGs e DETs). Este aprimoramento é vital para a identificação e quantificação precisas de DEGs ou DETs, particularmente em abordagens de sequenciamento em massa. Além disso, no sequenciamento unicelular, onde muitas vezes é necessária ampla amplificação por PCR, os UMIs de homotrímero provaram ser eficazes na mitigação dos efeitos dos artefatos de PCR, melhorando assim substancialmente a confiabilidade dos dados de sequenciamento.

“Ao construir UMIs a partir de blocos homogêneos de nucleosídeos, pretendemos melhorar a correção de erros tanto no sequenciamento de leitura curta quanto longa, demonstrando nosso compromisso em melhorar as aplicações de tecnologia de sequenciamento”, diz o professor associado Adam Cribbs, autor sênior do artigo e líder do grupo. em biologia computacional.

Esta pesquisa tem implicações profundas. Ao retificar erros de PCR em UMIs, aumenta enormemente a precisão da quantificação molecular em várias aplicações de sequenciamento. É uma ferramenta vital para pesquisadores em RNA em massa, RNA unicelular e sequenciamento de DNA, permitindo expressão genética precisa e análises de perfil molecular. A correção aprimorada de erros da UMI não apenas reduz a incidência de falsos positivos, mas também oferece múltiplas aplicações de diagnóstico, especialmente em cenários que necessitam de análise longitudinal de amostras.

O artigo, ' Corrigindo erros de amplificação de PCR em identificadores moleculares únicos para gerar números precisos de moléculas de sequenciamento ', pode ser lido na Nature Methods.