Saúde

Pesquisa recente sobre doenças neurodegenerativas
Este artigo explica a importância desses ensaios e a exigência de instrumentos rápidos e sensíveis que sejam capazes de analisar ensaios com várias técnicas de detecção.
Por Dr. Andrea Krumm - 11/05/2020

Atualmente, nos países desenvolvidos, a expectativa de vida é muito superior a 80 anos. No entanto, com uma expectativa de vida mais longa, aumentam as chances de desenvolver uma doença neurodegenerativa, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a demência. A progressão desses distúrbios resulta em uma situação cada vez mais debilitante até a necessidade de cuidados em tempo integral.

Infelizmente, a etiologia dessas doenças ainda não está completamente esclarecida, e a maioria dos medicamentos trata apenas os sintomas. Com o aumento da expectativa de vida, é essencial aprimorar nossa compreensão dessas doenças e desenvolver novas terapias.

Ensaios biológicos, incluindo agregação, citotoxicidade e ensaios de sinalização, são vitais para auxiliar os pesquisadores na compreensão dos mecanismos subjacentes a essas condições, além de descobrir tratamentos promissores nos estágios primários do desenvolvimento de drogas.

Este artigo explica a importância desses ensaios e a exigência de instrumentos rápidos e sensíveis que sejam capazes de analisar ensaios com várias técnicas de detecção.

O que são doenças neurodegenerativas?

Neurodegenerativo é um termo que se refere a doenças que geralmente são reconhecidas por sintomas como diminuição do controle motor, distúrbios de humor e déficits cognitivos. Como indicado pelo nome, as condições são caracterizadas pela degeneração dos neurônios. Os neurônios são células nervosas do cérebro e da medula espinhal que não se replicam.

Se os neurônios são danificados, eles não conseguem se recuperar, resultando em disfunção cerebral e doenças incuráveis. Apesar de haver semelhanças entre a neurodegeneração nas condições relacionadas, a origem das causas pode ser diferente.

Por exemplo, a doença de Huntington é desencadeada por uma mutação genética, a doença do príon Creutzfeldt Jakob é causada por uma proteína dobrada de maneira imprecisa (príon), e sugere-se que Parkinson e Alzheimer sejam causados ​​por uma combinação de fatores genéticos e ambientais e geralmente ocorrem em indivíduos com idade superior a de 60.

Uma característica semelhante entre essas condições neurodegenerativas é como o dano é induzido nos neurônios e, portanto, no cérebro. Proteínas dobradas incorretamente ocorrem na progressão de todas as condições mencionadas.

As fibrilas amilóides são formadas e agregam proteínas, resultando em um acúmulo de placas, potencialmente prejudicando células neuronais e tecido cerebral. Compreender e perturbar essa alteração é uma abordagem essencial para o tratamento da neurodegeneração, pois pode ser uma vantagem para pacientes com qualquer uma das condições.

Pesquisas recentes sobre doenças neurodegenerativas. 
Figura 1: As células nervosas (neurônios) são o alvo da neurodegeneração.
A perda de neurônios e função neuronal é devida à agregação anormal
de proteínas ou à sinalização reduzida. Na Doença de Parkinson, acúmulos
proteicos de alfa-sinucleína ocorrem dentro da célula (corpos de Lewy,
vermelhos na foto) e interrompem a função dos neurônios.
Crédito de imagem: BMG Labtech

Por que a pesquisa sobre doenças neurodegenerativas é tão importante?

As doenças neurodegenerativas imitam doenças cardiovasculares e câncer como principais causas de morte. Ao contrário das doenças cardiovasculares e do câncer, as doenças neurodegenerativas não conseguem ser curadas ou sua progressão diminui significativamente.

Os sintomas dos distúrbios nervosos são: movimento prejudicado, perda de memória, variações de humor, fala prejudicada e muitos outros.

Para começar, essas disfunções não prejudicam os pacientes a um nível significativo e podem continuar a viver uma vida independente. No entanto, à medida que a progressão das doenças continua, a qualidade de vida dos pacientes é reduzida drasticamente até que eles precisem de cuidados em tempo integral. Como conseqüência, também há um ônus social e financeiro durante a progressão da doença.

Atualmente, na Europa, são gastos cerca de 130 bilhões de euros por ano para cuidar de indivíduos com demência, uma consequência de condições neurodegenerativas. Com os aumentos observados no envelhecimento da população, a quantidade de pessoas afetadas também aumenta.

Em 2015, a doença de Alzheimer impactou 40 milhões de pessoas em todo o mundo, e estima-se que esse número atinja 130 milhões em 2030, com um terço a metade das pessoas com mais de 85 anos desenvolvendo essa doença. A duração média da doença de Alzheimer é de 2 a 10 anos, o que sem dúvida afeta o custo econômico previsto nos EUA, de US $ 1 trilhão por ano, desta doença até 2050.

Até o momento, há uma quantidade limitada de tratamentos usados ​​para doenças neurodegenerativas, e a maioria deles trata apenas os sintomas. Na verdade, não houve aprovação de novos medicamentos para a doença de Alzheimer na Europa nos últimos cinco anos.

Com isso em mente, terapias bem-sucedidas para retardar ou diminuir os sintomas dessas condições debilitantes são vitais para limitar a influência prejudicial que ela tem sobre indivíduos, famílias, sociedades e economias.

Um atraso no início da doença de Alzheimer em apenas cinco anos reduziria a carga financeira nos EUA em 50% e mostra que mesmo um pequeno atraso seria uma vantagem, permitindo maior independência do paciente e alívio para a família e seus compromissos e compromissos. a conta de saúde pública.

Identificação de alvos de medicamentos para doenças neurodegenerativas

Para a identificação de possíveis novos fármacos para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, é prático compreender a própria doença. Sintomas amplos e diferentes e com início lento característico, significa que o diagnóstico geralmente é feito apenas quando a doença já está progredindo.

Com isso em mente, ainda é evidente que ainda existem lacunas na compreensão desses distúrbios, especificamente os gatilhos e estágios iniciais das condições. Consequentemente, pesquisas fundamentais estão em andamento para oferecer uma compreensão mais detalhada dessas doenças e auxiliar na identificação de novos medicamentos.

Nos últimos 10 anos, o desenvolvimento de novos ensaios deu potencial ao estudo dos processos de neurodegeneração in vitro e em alta produtividade. Isso oferece o potencial de testar várias condições experimentais ou vários medicamentos em tempo extremamente curto.

Muitos ensaios importantes são ferramentas valiosas para a análise do caminho da doença e a avaliação dos efeitos de possíveis drogas. A seguir, explicam-se ensaios de agregação, citotoxicidade, sinalização e quantidade de proteínas e demonstram como eles ajudam no entendimento de doenças neurodegenerativas.

Estudos de doenças neurodegenerativas: ensaios de agregação

Uma característica principal das doenças neurodegenerativas é a criação de proteínas funcionais solúveis em agregados de proteínas insolúveis e altamente ordenados, denominados fibrilas ou placas amilóides. Essa transição começa com a formação de espécies pré-fibrilares (dímeros, tetrâmeros, hexâmeros etc.) antes de progredir para grandes complexos de agregados de proteínas.

No que diz respeito aos príons, tradicionalmente, modelos de animais inteiros têm sido utilizados para monitorar esses agregados de proteínas por meio de longos bioensaios que podem levar até 6 meses. Em 2012, nos Laboratórios Rocky Mountain, em Montana, um ensaio de agregação de taxa de transferência mais rápido e mais alto para o monitoramento da semeadura de prions foi desenvolvido pelos investigadores. Foi chamado ensaio de conversão induzida por quaking em tempo real (RT-QuIC).

O RT-QuIC utiliza intensidade de fluorescência para a medição da agregação de proteínas de príons. O corante fluorescente, tioflavina T (ThT), é adicionado às proteínas recombinantes e a molécula se liga a folhas beta criadas durante a formação de fibrilas, o que induz um aumento de fluorescência. A técnica é concluída em microplacas e utiliza proteína prion recombinante, proteína tau ou alfa-sinucleína. A placa é esporadicamente sacudida para permitir a quebra de fibrilas durante a agitação e a nova formação de fibrilas durante a quiescência.

O tempo necessário para concluir o método é de 168 horas, mas a formação de fibrilas aumenta em temperaturas mais altas. Devido a isso, o ensaio de agregação de proteínas é frequentemente concluído a 37 ° C ou superior. A combinação de alta temperatura, agitação intermitente e tempos de execução prolongados impõe altas exigências ao equipamento de medição.

A série de leitores de microplacas Omega mostrou que a evidência é robusta e confiável para concluir o trabalho tedioso, conforme resumido na nota de aplicação; "Ensaio de conversão induzida por quaking em tempo real para semeadura de príons".

Os Omegas foram selecionados como leitores de escolha para ensaios de agregação devido à sua incubação em alta temperatura (até 65 ° C), suporte de placa aprimorado e um sistema de transporte cada vez mais robusto. O webinar demonstra dicas e truques para otimização total das medições RT-QuiC .

Pesquisa publicada em 2016 descobriu que o RT-QuiC, realizado com líquido cefalorraquidiano, é um teste confiável para a doença esporádica de Creutzfeldt Jakob. Onze centros baseados na Europa, Ásia e Austrália analisaram as amostras humanas de LCR com leitores de placas RT-QuiC e BMG LABTECH (com uma exceção). Um diagnóstico da doença de Creutzfeldt Jakob dos centros ocorreu com 100% de concordância (McGuire et al. 2016).

Uma técnica apropriada para monitorar o início da agregação usa um novo fluoróforo: bis (trifenil fosfônio) tetrafeniletileno (TPE-TPP). O corante possui propriedades superiores ao corante ThT, pois é mais eficiente na ligação. Além disso, o monitoramento de sua polarização de fluorescência (FP) aparece nos estágios iniciais (dímeros, tetrâmeros) da agregação.

FP mede a rotação de moléculas em solução. As moléculas pequenas se movem rapidamente e despolarizam as emissões, enquanto as moléculas grandes se movem mais lentamente e mantêm a polarização das emissões. A ligação do TPE-TPP a estruturas (pré-) amilóides reduz a velocidade de sua rotação, resultando em alterações mensuráveis ​​no FP.

O ensaio foi desenvolvido por pesquisadores localizados na Austrália que utilizaram um leitor de microplacas CLARIOstar para concluir a medição de FP. Uma explicação em profundidade do ensaio pode ser encontrada na Nota de Aplicação: “O novo fluorogênio específico da agregação monitora a agregação de proteínas pré-fibrilares por polarização de fluorescência (FP)”.

Ensaios de viabilidade e toxicidade: melhor entendimento e modificação da morte neuronal

Além da agregação de proteínas, a morte celular neuronal é uma característica da neurodegeneração. Enquanto em adultos saudáveis ​​os neurônios são restritos à morte celular, durante doenças neurodegenerativas eles morrem, resultando em perda da função cerebral. Os neurônios morrem através de mecanismos de morte celular programada que podem ser causados ​​por dano oxidativo da mitocôndria ou DNA, dano à membrana por agregados de proteínas ou outros.

Mecanismos programados de morte celular observados nas células neuronais são apoptose, necrose e autofagia. Aprimorar o entendimento das causas da morte celular neuronal, seus mecanismos e como inibi-la é um método para descobrir medicamentos para doenças neurodegenerativas. Vários ensaios estudam a morte celular e ajudam a decifrar e modular a morte celular neuronal. Uma visão geral dos ensaios básicos de citotoxicidade é demonstrada na postagem do blog: “Citotoxicidade - esses ensaios indicam o que as células não gostam”.

Os ensaios de citotoxicidade mais frequentemente utilizados são formados com base em sais de tetrazólio. Sua diminuição nas células viáveis ​​resulta em uma mudança de absorvância que é registrada pelos leitores de microplacas e indica atividade metabólica. Os investigadores do Centro Nacional de Pesquisa Médica, Moscou, Rússia, usaram o ensaio para evidenciar que a insulina limita a excitotoxicidade nos neurônios corticais, um efeito que causa a morte celular nos neurônios que está associada a doenças neurodegenerativas (Krasil'nikova et al. 2019).

Devido à sua sensibilidade e simplicidade, os ensaios de viabilidade da luciferase dependente de ATP são populares. Eles medem o conteúdo de ATP das células lisadas por uma luciferase dependente de ATP. A saída de luz medida por um leitor de microplacas está diretamente ligada ao número da célula. O ensaio ajudou os pesquisadores em Cingapura a descobrir um efeito citotóxico da atividade da mononamina oxidase (MAO) em um modelo de célula de huntingtina (Ooi et al. 2015).

Ensaios de morte celular recentemente desenvolvidos relatam toxicidade em um ponto no tempo e também monitoram efeitos citotóxicos ao longo do tempo. O teste de viabilidade RealTime-Glo ™ gera luz quando células viáveis ​​estão presentes. Se as células são mantidas num ambiente de cultura (37 ° C, 5% de CO 2 ) por uma unidade de controlo atmosférico regulação gases dentro do leitor, é possível usá-lo para a viabilidade de monitorização em tempo real ao longo de dias.

A nova Unidade de Controle Atmosférica (ACU) do CLARIOstar oferece adaptabilidade em ensaios de células a longo prazo. Utilizando o ensaio em um leitor de microplacas CLARIOstar, o estudo de um efeito protetor de uma proteína de fusão específica contra neurotoxinas foi concluído (Paliga et al. 2019).

Ensaios de sinalização e função neuronal

Uma característica inicial da neurodegeneração é a sinalização neuronal enfraquecida. Processos de sinalização alterados incluem sinalização de Ca2 + que regula a transmissão sináptica, metabolismo energético e sobrevivência celular ou transmissão de sinal via receptores.

Pesquisas recentes sobre doenças neurodegenerativas 
Figura 2: A transmissão de sinal entre neurônios inclui sinalização via neurotransmissores
e receptores, íons e canais iônicos e induz respostas intracelulares de cálcio. A sinalização
prejudicada ocorre em doenças neurodegenerativas e a reversão da sinalização funcional
é uma abordagem terapêutica. Crédito de imagem: BMG Labtech

A sinalização de Ca 2+ nos neurônios é essencial para sua função celular como transmissores de informação. As variações intracelulares de Ca 2+ podem ser monitoradas usando corantes fluorescentes como Fura-2, Fluo-8 ou Cal-520. A nota de aplicação: “Monitorando o cálcio intracelular usando corantes fluorescentes em um ensaio de rendimento médio” é uma comparação dos diferentes ensaios que monitoram Ca 2+ .

Um exemplo de ensaios de Ca 2+ que auxiliam nos estudos de doenças neurodegenerativas é o uso do Fura-2 para desenvolver um modelo de neurônios diferenciados que são superiores na reflexão de neurônios em comparação com as células de neuroblastoma humano das quais elas derivam (Ferguson et al. 2016). As medidas intracelulares de Ca 2+ do Fura-2 demonstraram a estimulação de células diferenciadas com KCl, enquanto as células não diferenciadas não aumentaram os níveis intracelulares de Ca 2+ após o KCl.

Quantificação de biomarcadores de neurodegeneração

Foi descoberto um número de proteínas para demonstrar expressão alterada durante as diferentes doenças neurodegenerativas. Na doença de Alzheimer, a proteína Tau está implicada, os níveis do receptor TREM2 se correlacionam com o risco de desenvolver a doença de Alzheimer e o fator de crescimento do BDNF é reduzido na doença de Alzheimer. Para a doença de Parkinson, são observados níveis mais altos de neuroinflamação como IL6, IL β1 e TNF α.

Uma técnica popular para a quantificação de certas proteínas em solução são os ensaios ELISA. A nota de aplicação: “Rápido e detecção precisa de alvos doença de Alzheimer com SimpleStep ELISA ® kits e SPECTROstar ® Nano ”, descreve o princípio ELISA e demonstra como ele foi utilizado para quantificar as proteínas ligadas a neurodegeneração.

Pesquisadores baseados em Sydney, na Austrália, utilizaram um TNF-alfa ELISA para examinar o efeito da ativação microglial crônica no marcador inflamatório. Eles descobriram que o TNF-alfa pró-inflamatório era criado em todas as idades de um modelo de mouse com ativação microglial crônica, uma característica de doenças neurodegenerativas (Gyengesi et al. 2019).

Instrumentação para pesquisa em neurodegeneração

Esta pesquisa mostra técnicas de alto rendimento utilizadas em estudos com doenças neurodegenerativas como foco principal. Como vários modos de detecção são necessários, o uso de leitores de placas multimodo é sugerido para a pesquisa de doenças neurodegenerativas .

Para a realização de ensaios de agregação, é vital que a instrumentação de análise possa agitar e incubar microplacas por longos períodos de tempo, até 7 dias. A BMG Labtech é líder em tecnologia no campo de microplacas. Os leitores de placas multimodais incluem as séries CLARIOstar ® Plus e Omega, que incluem um suporte de placa dedicado e oferecem resistência em medições de agregação por agitação a longo prazo.

Agradecimentos
Produzido a partir de materiais de autoria original do Dr. Andrea Krumm na sede da BMG LABTECH.

 

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