Atualmente, nospaíses desenvolvidos, a expectativa de vida émuito superior a 80 anos. No entanto, com uma expectativa de vida mais longa, aumentam as chances de desenvolver uma doença neurodegenerativa, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a demaªncia. A progressão desses distúrbios resulta em uma situação cada vez mais debilitante atéa necessidade de cuidados em tempo integral.

Infelizmente, a etiologia dessas doenças ainda não estãocompletamente esclarecida, e a maioria dos medicamentos trata apenas os sintomas. Com o aumento da expectativa de vida, éessencial aprimorar nossa compreensão dessas doenças e desenvolver novas terapias.

Ensaios biola³gicos, incluindo agregação, citotoxicidade e ensaios de sinalização, são vitais para auxiliar os pesquisadores na compreensão dos mecanismos subjacentes a essas condições, além de descobrir tratamentos promissores nos esta¡gios prima¡rios do desenvolvimento de drogas.

Este artigo explica a importa¢ncia desses ensaios e a exigaªncia de instrumentos rápidos e sensa­veis que sejam capazes de analisar ensaios com várias técnicas de detecção.

Neurodegenerativo éum termo que se refere a doenças que geralmente são reconhecidas por sintomas como diminuição do controle motor, distúrbios de humor e danãficits cognitivos. Como indicado pelo nome, as condições são caracterizadas pela degeneração dos neura´nios. Os neura´nios são células nervosas do cérebro e da medula espinhal que não se replicam.

Se os neura´nios são danificados, eles não conseguem se recuperar, resultando em disfunção cerebral e doenças incura¡veis. Apesar de haver semelhanças entre a neurodegeneração nas condições relacionadas, a origem das causas pode ser diferente.

Por exemplo, a doença de Huntington édesencadeada por uma mutação genanãtica, a doença do pra­on Creutzfeldt Jakob écausada por uma protea­na dobrada de maneira imprecisa (pra­on), e sugere-se que Parkinson e Alzheimer sejam causados ​​por uma combinação de fatores genanãticos e ambientais e geralmente ocorrem em indivíduos com idade superior a de 60.

Uma caracterí­stica semelhante entre essas condições neurodegenerativas écomo o dano éinduzido nos neura´nios e, portanto, no cérebro. Protea­nas dobradas incorretamente ocorrem na progressão de todas as condições mencionadas.

As fibrilas amila³ides são formadas e agregam protea­nas, resultando em um acaºmulo de placas, potencialmente prejudicando células neuronais e tecido cerebral. Compreender e perturbar essa alteração éuma abordagem essencial para o tratamento da neurodegeneração, pois pode ser uma vantagem para pacientes com qualquer uma das condições.

As doenças neurodegenerativas imitam doenças cardiovasculares e câncer como principais causas de morte. Ao contra¡rio das doenças cardiovasculares e do ca¢ncer, as doenças neurodegenerativas não conseguem ser curadas ou sua progressão diminui significativamente.

Os sintomas dos distúrbios nervosos são: movimento prejudicado, perda de memória, variações de humor, fala prejudicada e muitos outros.

Para comea§ar, essas disfunções não prejudicam os pacientes a umnívelsignificativo e podem continuar a viver uma vida independente. No entanto, a  medida que a progressão das doenças continua, a qualidade de vida dos pacientes éreduzida drasticamente atéque eles precisem de cuidados em tempo integral. Como conseqa¼aªncia, também háum a´nus social e financeiro durante a progressão da doena§a.

Atualmente, na Europa, são gastos cerca de 130 bilhaµes de euros por ano para cuidar de indivíduos com demaªncia, uma consequaªncia de condições neurodegenerativas. Com os aumentos observados no envelhecimento da população, a quantidade de pessoas afetadas também aumenta.

Em 2015, a doença de Alzheimer impactou 40 milhões de pessoas em todo o mundo, e estima-se que esse número atinja 130 milhões em 2030, com um tera§o a metade das pessoas com mais de 85 anos desenvolvendo essa doena§a. A duração média da doença de Alzheimer éde 2 a 10 anos, o que sem daºvida afeta o custo econa´mico previsto nos EUA, de US $ 1 trilha£o por ano, desta doença até2050.

Atéo momento, háuma quantidade limitada de tratamentos usados ​​para doenças neurodegenerativas, e a maioria deles trata apenas os sintomas. Na verdade, não houve aprovação de novos medicamentos para a doença de Alzheimer na Europa nos últimos cinco anos.

Com isso em mente, terapias bem-sucedidas para retardar ou diminuir os sintomas dessas condições debilitantes são vitais para limitar a influaªncia prejudicial que ela tem sobre indiva­duos, fama­lias, sociedades e economias.

Um atraso no ini­cio da doença de Alzheimer em apenas cinco anos reduziria a carga financeira nos EUA em 50% e mostra que mesmo um pequeno atraso seria uma vantagem, permitindo maior independaªncia do paciente e ala­vio para a familia e seus compromissos e compromissos. a conta de saúde pública.

Para a identificação de possa­veis novos fa¡rmacos para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos, éprático compreender a própria doena§a. Sintomas amplos e diferentes e com ini­cio lento caractera­stico, significa que o diagnóstico geralmente éfeito apenas quando a doença já estãoprogredindo.

Com isso em mente, ainda éevidente que ainda existem lacunas na compreensão desses distúrbios, especificamente os gatilhos e esta¡gios iniciais das condições. Consequentemente, pesquisas fundamentais estãoem andamento para oferecer uma compreensão mais detalhada dessas doenças e auxiliar na identificação de novos medicamentos.

Nos últimos 10 anos, o desenvolvimento de novos ensaios deu potencial ao estudo dos processos de neurodegeneração in vitro e em alta produtividade. Isso oferece o potencial de testar várias condições experimentais ou vários medicamentos em tempo extremamente curto.

Muitos ensaios importantes são ferramentas valiosas para a análise do caminho da doença e a avaliação dos efeitos de possa­veis drogas. A seguir, explicam-se ensaios de agregação, citotoxicidade, sinalização e quantidade de protea­nas e demonstram como eles ajudam no entendimento de doenças neurodegenerativas.

Uma caracterí­stica principal das doenças neurodegenerativas éa criação de protea­nas funcionais solaºveis em agregados de protea­nas insolaºveis e altamente ordenados, denominados fibrilas ou placas amila³ides. Essa transição comea§a com a formação de espanãcies pré-fibrilares (da­meros, tetra¢meros, hexa¢meros etc.) antes de progredir para grandes complexos de agregados de protea­nas.

No que diz respeito aos pra­ons, tradicionalmente, modelos de animais inteiros tem sido utilizados para monitorar esses agregados de protea­nas por meio de longos bioensaios que podem levar até6 meses. Em 2012, nos Laborata³rios Rocky Mountain, em Montana, um ensaio de agregação de taxa de transferaªncia mais rápido e mais alto para o monitoramento da semeadura de prions foi desenvolvido pelos investigadores. Foi chamado ensaio de conversão induzida por quaking em tempo real (RT-QuIC).

O RT-QuIC utiliza intensidade de fluorescaªncia para a medição da agregação de protea­nas de pra­ons. O corante fluorescente, tioflavina T (ThT), éadicionado a s protea­nas recombinantes e a molanãcula se liga a folhas beta criadas durante a formação de fibrilas, o que induz um aumento de fluorescaªncia. A técnica éconclua­da em microplacas e utiliza protea­na prion recombinante, protea­na tau ou alfa-sinuclea­na. A placa éesporadicamente sacudida para permitir a quebra de fibrilas durante a agitação e a nova formação de fibrilas durante a quiescaªncia.

O tempo necessa¡rio para concluir o manãtodo éde 168 horas, mas a formação de fibrilas aumenta em temperaturas mais altas. Devido a isso, o ensaio de agregação de protea­nas éfrequentemente conclua­do a 37 ° C ou superior. A combinação de alta temperatura, agitação intermitente e tempos de execução prolongados impaµe altas exigaªncias ao equipamento de medição.

A sanãrie de leitores de microplacas Omega mostrou que a evidência érobusta e confia¡vel para concluir o trabalho tedioso, conforme resumido na nota de aplicação; "Ensaio de conversão induzida por quaking em tempo real para semeadura de pra­ons".

Os Omegas foram selecionados como leitores de escolha para ensaios de agregação devido a  sua incubação em alta temperatura (até65 ° C), suporte de placa aprimorado e um sistema de transporte cada vez mais robusto. O webinar demonstra dicas e truques para otimização total das medições RT-QuiC .

Uma técnica apropriada para monitorar o ini­cio da agregação usa um novo fluora³foro: bis (trifenil fosfa´nio) tetrafeniletileno (TPE-TPP). O corante possui propriedades superiores ao corante ThT, pois émais eficiente na ligação. Além disso, o monitoramento de sua polarização de fluorescaªncia (FP) aparece nos esta¡gios iniciais (da­meros, tetra¢meros) da agregação.

FP mede a rotação de moléculas em solução. As moléculas pequenas se movem rapidamente e despolarizam as emissaµes, enquanto as moléculas grandes se movem mais lentamente e mantem a polarização das emissaµes. A ligação do TPE-TPP a estruturas (pré-) amila³ides reduz a velocidade de sua rotação, resultando em alterações mensura¡veis ​​no FP.

O ensaio foi desenvolvido por pesquisadores localizados na Austra¡lia que utilizaram um leitor de microplacas CLARIOstar para concluir a medição de FP. Uma explicação em profundidade do ensaio pode ser encontrada na Nota de Aplicação: “O novo fluorogaªnio especa­fico da agregação monitora a agregação de protea­nas pré-fibrilares por polarização de fluorescaªncia (FP)”.

Além da agregação de protea­nas, a morte celular neuronal éuma caracterí­stica da neurodegeneração. Enquanto em adultos sauda¡veis ​​os neura´nios são restritos a  morte celular, durante doenças neurodegenerativas eles morrem, resultando em perda da função cerebral. Os neura´nios morrem atravanãs de mecanismos de morte celular programada que podem ser causados ​​por dano oxidativo da mitoca´ndria ou DNA, dano a  membrana por agregados de protea­nas ou outros.

Mecanismos programados de morte celular observados nas células neuronais são apoptose, necrose e autofagia. Aprimorar o entendimento das causas da morte celular neuronal, seus mecanismos e como inibi-la éum manãtodo para descobrir medicamentos para doenças neurodegenerativas. Va¡rios ensaios estudam a morte celular e ajudam a decifrar e modular a morte celular neuronal. Uma visão geral dos ensaios ba¡sicos de citotoxicidade édemonstrada na postagem do blog: “Citotoxicidade - esses ensaios indicam o que as células não gostam”.

Os ensaios de citotoxicidade mais frequentemente utilizados são formados com base em sais de tetraza³lio. Sua diminuição nas células via¡veis ​​resulta em uma mudança de absorva¢ncia que éregistrada pelos leitores de microplacas e indica atividade metaba³lica. Os investigadores do Centro Nacional de Pesquisa Manãdica, Moscou, Raºssia, usaram o ensaio para evidenciar que a insulina limita a excitotoxicidade nos neura´nios corticais, um efeito que causa a morte celular nos neura´nios que estãoassociada a doenças neurodegenerativas (Krasil'nikova et al. 2019).

Devido a  sua sensibilidade e simplicidade, os ensaios de viabilidade da luciferase dependente de ATP são populares. Eles medem o conteaºdo de ATP das células lisadas por uma luciferase dependente de ATP. A saa­da de luz medida por um leitor de microplacas estãodiretamente ligada ao número da canãlula. O ensaio ajudou os pesquisadores em Cingapura a descobrir um efeito citota³xico da atividade da mononamina oxidase (MAO) em um modelo de canãlula de huntingtina (Ooi et al. 2015).

Ensaios de morte celular recentemente desenvolvidos relatam toxicidade em um ponto no tempo e também monitoram efeitos citota³xicos ao longo do tempo. O teste de viabilidade RealTime-Glo â„¢ gera luz quando células via¡veis ​​estãopresentes. Se as células são mantidas num ambiente de cultura (37 ° C, 5% de CO 2 ) por uma unidade de controlo atmosfanãrico regulação gases dentro do leitor, épossí­vel usa¡-lo para a viabilidade de monitorização em tempo real ao longo de dias.

A nova Unidade de Controle Atmosfanãrica (ACU) do CLARIOstar oferece adaptabilidade em ensaios de células a longo prazo. Utilizando o ensaio em um leitor de microplacas CLARIOstar, o estudo de um efeito protetor de uma protea­na de fusão especa­fica contra neurotoxinas foi conclua­do (Paliga et al. 2019).

Uma caracterí­stica inicial da neurodegeneração éa sinalização neuronal enfraquecida. Processos de sinalização alterados incluem sinalização de Ca2 + que regula a transmissão sina¡ptica, metabolismo energanãtico e sobrevivaªncia celular ou transmissão de sinal via receptores.

A sinalização de Ca 2+ nos neura´nios éessencial para sua função celular como transmissores de informação. As variações intracelulares de Ca 2+ podem ser monitoradas usando corantes fluorescentes como Fura-2, Fluo-8 ou Cal-520. A nota de aplicação: “Monitorando o ca¡lcio intracelular usando corantes fluorescentes em um ensaio de rendimento manãdio” éuma comparação dos diferentes ensaios que monitoram Ca 2+ .

Um exemplo de ensaios de Ca 2+ que auxiliam nos estudos de doenças neurodegenerativas éo uso do Fura-2 para desenvolver um modelo de neura´nios diferenciados que são superiores na reflexa£o de neura´nios em comparação com as células de neuroblastoma humano das quais elas derivam (Ferguson et al. 2016). As medidas intracelulares de Ca 2+ do Fura-2 demonstraram a estimulação de células diferenciadas com KCl, enquanto as células não diferenciadas não aumentaram os na­veis intracelulares de Ca 2+ após o KCl.

Foi descoberto um número de protea­nas para demonstrar expressão alterada durante as diferentes doenças neurodegenerativas. Na doença de Alzheimer, a protea­na Tau estãoimplicada, os na­veis do receptor TREM2 se correlacionam com o risco de desenvolver a doença de Alzheimer e o fator de crescimento do BDNF éreduzido na doença de Alzheimer. Para a doença de Parkinson, são observados na­veis mais altos de neuroinflamação como IL6, IL β1 e TNF α.

Uma técnica popular para a quantificação de certas protea­nas em solução são os ensaios ELISA. A nota de aplicação: “Ra¡pido e detecção precisa de alvos doença de Alzheimer com SimpleStep ELISA ® kits e SPECTROstar ® Nano ”, descreve o princa­pio ELISA e demonstra como ele foi utilizado para quantificar as protea­nas ligadas a neurodegeneração.

Pesquisadores baseados em Sydney, na Austra¡lia, utilizaram um TNF-alfa ELISA para examinar o efeito da ativação microglial crônica no marcador inflamata³rio. Eles descobriram que o TNF-alfa pra³-inflamata³rio era criado em todas as idades de um modelo de mouse com ativação microglial crônica, uma caracterí­stica de doenças neurodegenerativas (Gyengesi et al. 2019).

Esta pesquisa mostra técnicas de alto rendimento utilizadas em estudos com doenças neurodegenerativas como foco principal. Como vários modos de detecção são necessa¡rios, o uso de leitores de placas multimodo ésugerido para a pesquisa de doenças neurodegenerativas .

Para a realização de ensaios de agregação, évital que a instrumentação de análise possa agitar e incubar microplacas por longos períodos de tempo, até7 dias. A BMG Labtech élider em tecnologia no campo de microplacas. Os leitores de placas multimodais incluem as sanãries CLARIOstar ® Plus e Omega, que incluem um suporte de placa dedicado e oferecem resistência em medições de agregação por agitação a longo prazo.