Saúde

Teste de malária baseado em CRISPR em tempo real
Um ensaio de diagnóstico ultrassensível específico para a espécie permitirá o teste de portadores em ambientes com poucos recursos
Por Benjamin Boettner - 21/09/2020


Crédito: Wyss Institute da Harvard University

Em esforços contínuos para erradicar a malária, um teste ultrassensível que oferece recursos diagnósticos rápidos e específicos da espécie foi desenvolvido por uma colaboração de pesquisa liderada por James Collins , um membro do corpo docente do Instituto Wyss de Engenharia Inspirada na Biologia de Harvard.

Para atingir a meta estabelecida pelo Programa Global de Controle da Malária da Organização Mundial da Saúde (OMS) , toda a transmissão local de parasitas da malária em áreas geográficas definidas deve ser eliminada. O desenvolvimento de testes que sejam úteis em ambientes de poucos recursos em muitas áreas com malária endêmica é fundamental.

Atualmente, a presença das quatro principais espécies P de Plasmodium causadoras de malária . falciparum , P . vivax , P . ovale , e P . malariae é determinada por análise microscópica de amostras de sangue nas quais os parasitas podem ser detectados nas células vermelhas do sangue, ou com os chamados testes de diagnóstico rápido para proteínas específicas do Plasmodium (antígenos).

"Infelizmente, as abordagens de diagnóstico rápido disponíveis não conseguem distinguir todas as quatro espécies de Plasmodium umas das outras, o que pode ser importante para iniciar o curso definitivo de tratamento", disse Nira Pollock , diretora médica associada do Laboratório de Diagnóstico de Doenças Infecciosas do Hospital Infantil de Boston e professor associado de patologia e medicina na Harvard Medical School (HMS). “E, o mais importante, eles são ineficazes para detectar baixos números de parasitas Plasmodium em indivíduos assintomáticos.”

“Esses 'portadores assintomáticos' são reservatórios silenciosos para a transmissão contínua por mosquitos disseminadores da malária e extremamente importantes para os esforços globais em curso para erradicar a malária”, acrescentou Jeffrey Dvorin , professor associado de pediatria do HMS e médico associado sênior em doenças infecciosas no Hospital Infantil de Boston .

A equipe de pesquisa, montada pela colega clínica Rose Lee e incluiu Pollock e Dvorin, criou um ensaio diagnóstico ultrassensível aplicável em campo que detecta especificamente sequências de DNA de todas as espécies de Plasmodium na malária sintomática e assintomática. O novo método combina um protocolo de preparação rápida de amostra de 10 minutos otimizado com o sistema SHERLOCK baseado em CRISPR para permitir a detecção de Plasmodium altamente específica e sensível em outros 60 minutos em dispositivos repórter simples. Está publicado no PNAS.

“Este ensaio de diagnóstico de malária SHERLOCK pronto para campo ultrapassa os requisitos de sensibilidade e especificidade definidos pela OMS para um teste desejado que pode ser usado para detectar baixa densidade de parasitas em portadores assintomáticos de todas as principais espécies de Plasmodium”, disse Collins. “Seu design altamente simplificado pode fornecer uma solução viável para o atual gargalo de diagnóstico no caminho para eliminar a malária e, de forma mais geral, permitir a vigilância da malária em locais com poucos recursos.”

Collins é líder da Área de Foco de Dispositivos Celulares Vivos do Instituto Wyss e também Professor de Engenharia Médica e Ciência do Termeer no MIT.

Os membros da equipe demonstraram que seu ensaio SHERLOCK (desbloqueio de repórter enzimático específico de alta sensibilidade) é capaz de detectar menos de dois parasitas por microlitro de sangue, o "limite de detecção" sugerido pela OMS (LOD) para um teste com ampla utilidade em áreas endêmicas . Mostrando potencial clínico do ensaio através da análise de amostras clínicas que contenham P . falciparum e P . espécies vivax , eles as chamaram com 100 por cento de sensibilidade, identificando corretamente amostras positivas verdadeiras, e 100 por cento de especificidade, identificando também amostras sem uma determinada espécie de Plasmodium em amostras verdadeiramente negativas.

Quase 100% de sensibilidade e especificidade são atributos-chave dos ensaios de diagnóstico a serem usados ​​em testes do mundo real. Além disso, o ensaio é projetado de forma que também possa determinar a presença de P frequentemente mutado . cepas de falciparum que perderam seu antígeno HRP2 e, portanto, escapam da detecção por testes de diagnóstico rápido comuns.

O grupo de Collins no Wyss Institute e o MIT co-desenvolveram a tecnologia SHERLOCK com o grupo de Feng Zhang no Broad Institute. Foi licenciado para a Sherlock Biosciences, uma startup que o usou para criar um diagnóstico molecular rápido para outras aplicações de doenças, e recentemente recebeu uma autorização de uso emergencial do FDA para seu diagnóstico rápido COVID-19.

Outros métodos foram desenvolvidos que, como o novo ensaio SHERLOCK, amplificam e detectam o DNA (ou RNA) material de ácido nucléico de espécies de Plasmodium. No entanto, até o momento, esses métodos permanecem limitados pela necessidade de equipamentos de laboratório caros.

“É importante ressaltar que o ensaio é compatível com diferentes tipos de amostra, como sangue total, plasma, soro e sangue seco, e todos os componentes necessários para amplificação, ativação de Cas12a e geração de sinal podem ser liofilizados em um único tubo de ensaio para funcionarem juntos em um reação em um único vaso após serem reconstituídos e misturados com a amostra do paciente ”, disse a primeira autora Rose Lee, pesquisadora clínica do grupo de Collins e do Boston Children's Hospital. “Isso ... permite que o teste seja realizado em configurações de poucos recursos com conhecimento mínimo.”

Adaptado de um artigo online do Wyss Institute.

 

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