Em uma sanãrie de experimentos com bactanãrias cultivadas em laboratório, os cientistas da Johns Hopkins encontraram evidaªncias de que háum segundo papel para o sistema de corte de genes amplamente usado CRISPR-Cas9 - como um interruptor de dimmer genanãtico para genes CRISPR-Cas9. Seu papel de reduzir ou diminuir a atividade do CRISPR-Cas9 pode ajudar os cientistas a desenvolver novas maneiras de manipular células geneticamente para fins de pesquisa.

Um resumo das descobertas foi publicado recentemente na Cell .

Identificado pela primeira vez no genoma de bactanãrias intestinais em 1987, o CRISPR-Cas9 éum grupo de genes de ocorraªncia natural, mas incomum, com potencial para cortar sequaªncias de DNA em outros tipos de células, realizado 25 anos depois. Seu valor na engenharia genanãtica - alteração de gene programa¡vel em células vivas, incluindo células humanas - foi rapidamente apreciado, e seu uso generalizado como um "editor" de genoma em milhares de laboratórios em todo o mundo foi reconhecido na entrega do Praªmio Nobel de Quí­mica no ano passado para seus co-desenvolvedores americanos e franceses.

CRISPR significa repetições palindra´micas curtas agrupadas e regularmente espaa§adas. Cas9, que se refere a  protea­na 9 associada a CRISPR, éo nome da enzima que forma a fatia de DNA. As bactanãrias usam naturalmente CRISPR-Cas9 para cortar o DNA viral ou outro potencialmente prejudicial e desativar a ameaa§a, diz Joshua Modell , professor assistente de biologia molecular e genanãtica na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins. Nessa função, Modell diz, "CRISPR não éapenas um sistema imunológico, éum sistema imunológico adaptativo - aquele que pode se lembrar de ameaa§as que encontrou anteriormente, segurando um pequeno pedaço de seu DNA, que ésemelhante a uma foto de pola­cia." Essas fotos são então copiadas em "RNAs guia" que dizem a Cas9 o que cortar.

Os cientistas trabalharam por muito tempo para desvendar as etapas precisas do mecanismo do CRISPR-Cas9 e como sua atividade nas bactanãrias éaumentada ou diminua­da. Procurando por genes que ativam ou inibem o sistema de corte de genes CRISPR-Cas9 para a bactanãria Streptococcus pyogenes , causadora de infecção estreptoca³cica , os cientistas da Johns Hopkins encontraram uma pista sobre como esse aspecto do sistema funciona.

Especificamente, os cientistas encontraram um gene no sistema CRISPR-Cas9 que, quando desativado, levou a um aumento drama¡tico na atividade do sistema nas bactanãrias. O produto deste gene pareceu reprogramar Cas9 para agir como um freio, ao invanãs de uma "tesoura", para desacelerar o sistema CRISPR.

"Do ponto de vista da imunidade, as bactanãrias precisam aumentar a atividade do CRISPR-Cas9 para identificar e livrar a canãlula das ameaa§as, mas também precisam diminua­-la para evitar a autoimunidade - quando o sistema imunológico ataca por engano os pra³prios componentes das bactanãrias", diz a estudante de graduação Rachael Workman, bacteriologista que trabalha no laboratório de Modell.

Para definir ainda mais as particularidades do "freio", o pra³ximo passo da equipe foi entender melhor o produto do gene desativado (tracrRNA). O RNA éum primo genanãtico do DNA e évital para executar as "instruções" do DNA para a produção de protea­nas. Os tracrRNAs pertencem a uma familia única de RNAs que não produzem protea­nas. Em vez disso, eles agem como uma espanãcie de estrutura que permite que a enzima Cas9 carregue o RNA guia contendo a foto do va­rus invasor e corte as sequaªncias de DNA correspondentes do va­rus.

TracrRNA vem em dois tamanhos: longo e curto. A maioria das ferramentas modernas de corte de genes CRISPR-Cas9 usa a forma abreviada. No entanto, a equipe de pesquisa descobriu que o produto do gene desativado era a forma longa do tracrRNA, cuja função era totalmente desconhecida.

As formas longa e curta de tracrRNA são semelhantes em estrutura e tem em comum a capacidade de se ligar a Cas9. A forma curta tracrRNA também se liga ao RNA guia. No entanto, o tracrRNA de forma longa não precisa se ligar ao RNA guia porque já contanãm um segmento que imita o RNA guia. "Essencialmente, os tracrRNAs de forma longa combinaram a função do tracrRNA de forma curta e o RNA guia", diz Modell.

Além disso, os pesquisadores descobriram que, embora os RNAs guia normalmente busquem sequaªncias de DNA viral, os tracrRNAs de forma longa tem como alvo o pra³prio sistema CRISPR-Cas9. A forma longa do tracrRNA tende a ficar no DNA, ao invanãs de corta¡-lo. Quando isso acontece em uma área especa­fica de um gene, impede que o gene se expresse - ou se torne funcional.

Para confirmar isso, os pesquisadores usaram a engenharia genanãtica para alterar o comprimento de uma certa regia£o no tracrRNA de forma longa para fazer o tracrRNA parecer mais um RNA guia. Eles descobriram que, com a forma longa alterada do tracrRNA, Cas9 mais uma vez se comportou mais como uma tesoura.

Outros experimentos mostraram que em bactanãrias cultivadas em laboratório com uma quantidade abundante de tracrRNA de forma longa, os na­veis de todos os genes relacionados ao CRISPR eram muito baixos. Quando o tracrRNA de forma longa foi removido das bactanãrias, no entanto, a expressão dos genes CRISPR-Cas9 aumentou cem vezes.

Canãlulas bacterianas sem o tracrRNA de forma longa foram cultivadas em laboratório por três dias e comparadas com células cultivadas de forma semelhante contendo o tracrRNA de forma longa. Ao final do experimento, as bactanãrias sem a forma longa do tracrRNA morreram completamente, sugerindo que a forma longa do tracrRNA normalmente protege as células da doença e da morte que acontecem quando a atividade do CRISPR-Cas9 émuito alta.

“Comea§amos a ter a ideia de que o formula¡rio longo estava reprimindo, mas não eliminando sua própria atividade relacionada ao CRISPR”, diz Workman.

Para ver se o tracrRNA de forma longa poderia ser reprogramado para reprimir outros genes bacterianos, a equipe de pesquisa alterou a regia£o espaa§adora do tracrRNA de forma longa para deixa¡-lo assentar em um gene que produz fluorescaªncia verde. Bactanãrias com esta versão mutada do tracrRNA de forma longa brilhavam menos verdes do que bactanãrias contendo o tracrRNA de forma longa normal, sugerindo que o tracrRNA de forma longa pode ser geneticamente modificado para reduzir outros genes bacterianos.

Os pesquisadores também descobriram os componentes genanãticos do tracrRNA de forma longa em cerca de 40% do grupo de bactanãrias Streptococcus. Um estudo mais aprofundado de cepas bacterianas que não tem o tracrRNA de forma longa, diz Workman, ira¡ potencialmente revelar se seus sistemas CRISPR-Cas9 estãointactos e outras maneiras pelas quais as bactanãrias podem retardar o sistema CRISPR-Cas9.

A capacidade do dimmer que os experimentos descobriram, diz Modell, oferece oportunidades para projetar novas ou melhores ferramentas CRISPR-Cas9 destinadas a regular a atividade do gene para fins de pesquisa. "Em um cena¡rio de edição de genes, um pesquisador pode querer cortar um gene especa­fico, além de usar a forma longa tracrRNA para inibir a atividade do gene", diz ele.