Saúde

A ferramenta de edição de genes tesoura CRISPR-CAS9 também pode ser um interruptor de dimmer genético
Biólogos moleculares e geneticistas da Johns Hopkins identificam o papel do RNA especializado na repressão da atividade genética
Por Vanessa Wasta - 30/01/2021


Getty Images

Em uma série de experimentos com bactérias cultivadas em laboratório, os cientistas da Johns Hopkins encontraram evidências de que há um segundo papel para o sistema de corte de genes amplamente usado CRISPR-Cas9 - como um interruptor de dimmer genético para genes CRISPR-Cas9. Seu papel de reduzir ou diminuir a atividade do CRISPR-Cas9 pode ajudar os cientistas a desenvolver novas maneiras de manipular células geneticamente para fins de pesquisa.

Um resumo das descobertas foi publicado recentemente na Cell .

Identificado pela primeira vez no genoma de bactérias intestinais em 1987, o CRISPR-Cas9 é um grupo de genes de ocorrência natural, mas incomum, com potencial para cortar sequências de DNA em outros tipos de células, realizado 25 anos depois. Seu valor na engenharia genética - alteração de gene programável em células vivas, incluindo células humanas - foi rapidamente apreciado, e seu uso generalizado como um "editor" de genoma em milhares de laboratórios em todo o mundo foi reconhecido na entrega do Prêmio Nobel de Química no ano passado para seus co-desenvolvedores americanos e franceses.

"DO PONTO DE VISTA DA IMUNIDADE, AS BACTÉRIAS PRECISAM AUMENTAR A ATIVIDADE DO CRISPR-CAS9 PARA IDENTIFICAR E LIVRAR A CÉLULA DAS AMEAÇAS, MAS TAMBÉM PRECISAM DIMINUÍ-LA PARA EVITAR A AUTOIMUNIDADE - QUANDO O SISTEMA IMUNOLÓGICO ATACA ERRONEAMENTE OS COMPONENTES DAS PRÓPRIAS BACTÉRIAS."

Rachael Workman
Estudante de pós-graduação, Johns Hopkins School of Medicine

CRISPR significa repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas. Cas9, que se refere à proteína 9 associada a CRISPR, é o nome da enzima que forma a fatia de DNA. As bactérias usam naturalmente CRISPR-Cas9 para cortar o DNA viral ou outro potencialmente prejudicial e desativar a ameaça, diz Joshua Modell , professor assistente de biologia molecular e genética na Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins. Nessa função, Modell diz, "CRISPR não é apenas um sistema imunológico, é um sistema imunológico adaptativo - aquele que pode se lembrar de ameaças que encontrou anteriormente, segurando um pequeno pedaço de seu DNA, que é semelhante a uma foto de polícia." Essas fotos são então copiadas em "RNAs guia" que dizem a Cas9 o que cortar.

Os cientistas trabalharam por muito tempo para desvendar as etapas precisas do mecanismo do CRISPR-Cas9 e como sua atividade nas bactérias é aumentada ou diminuída. Procurando por genes que ativam ou inibem o sistema de corte de genes CRISPR-Cas9 para a bactéria Streptococcus pyogenes , causadora de infecção estreptocócica , os cientistas da Johns Hopkins encontraram uma pista sobre como esse aspecto do sistema funciona.

Especificamente, os cientistas encontraram um gene no sistema CRISPR-Cas9 que, quando desativado, levou a um aumento dramático na atividade do sistema nas bactérias. O produto deste gene pareceu reprogramar Cas9 para agir como um freio, ao invés de uma "tesoura", para desacelerar o sistema CRISPR.

"Do ponto de vista da imunidade, as bactérias precisam aumentar a atividade do CRISPR-Cas9 para identificar e livrar a célula das ameaças, mas também precisam diminuí-la para evitar a autoimunidade - quando o sistema imunológico ataca por engano os próprios componentes das bactérias", diz a estudante de graduação Rachael Workman, bacteriologista que trabalha no laboratório de Modell.

Para definir ainda mais as particularidades do "freio", o próximo passo da equipe foi entender melhor o produto do gene desativado (tracrRNA). O RNA é um primo genético do DNA e é vital para executar as "instruções" do DNA para a produção de proteínas. Os tracrRNAs pertencem a uma família única de RNAs que não produzem proteínas. Em vez disso, eles agem como uma espécie de estrutura que permite que a enzima Cas9 carregue o RNA guia contendo a foto do vírus invasor e corte as sequências de DNA correspondentes do vírus.

TracrRNA vem em dois tamanhos: longo e curto. A maioria das ferramentas modernas de corte de genes CRISPR-Cas9 usa a forma abreviada. No entanto, a equipe de pesquisa descobriu que o produto do gene desativado era a forma longa do tracrRNA, cuja função era totalmente desconhecida.

As formas longa e curta de tracrRNA são semelhantes em estrutura e têm em comum a capacidade de se ligar a Cas9. A forma curta tracrRNA também se liga ao RNA guia. No entanto, o tracrRNA de forma longa não precisa se ligar ao RNA guia porque já contém um segmento que imita o RNA guia. "Essencialmente, os tracrRNAs de forma longa combinaram a função do tracrRNA de forma curta e o RNA guia", diz Modell.

Além disso, os pesquisadores descobriram que, embora os RNAs guia normalmente busquem sequências de DNA viral, os tracrRNAs de forma longa têm como alvo o próprio sistema CRISPR-Cas9. A forma longa do tracrRNA tende a ficar no DNA, ao invés de cortá-lo. Quando isso acontece em uma área específica de um gene, impede que o gene se expresse - ou se torne funcional.

Para confirmar isso, os pesquisadores usaram a engenharia genética para alterar o comprimento de uma certa região no tracrRNA de forma longa para fazer o tracrRNA parecer mais um RNA guia. Eles descobriram que, com a forma longa alterada do tracrRNA, Cas9 mais uma vez se comportou mais como uma tesoura.

Outros experimentos mostraram que em bactérias cultivadas em laboratório com uma quantidade abundante de tracrRNA de forma longa, os níveis de todos os genes relacionados ao CRISPR eram muito baixos. Quando o tracrRNA de forma longa foi removido das bactérias, no entanto, a expressão dos genes CRISPR-Cas9 aumentou cem vezes.

Células bacterianas sem o tracrRNA de forma longa foram cultivadas em laboratório por três dias e comparadas com células cultivadas de forma semelhante contendo o tracrRNA de forma longa. Ao final do experimento, as bactérias sem a forma longa do tracrRNA morreram completamente, sugerindo que a forma longa do tracrRNA normalmente protege as células da doença e da morte que acontecem quando a atividade do CRISPR-Cas9 é muito alta.

“Começamos a ter a ideia de que o formulário longo estava reprimindo, mas não eliminando sua própria atividade relacionada ao CRISPR”, diz Workman.

Para ver se o tracrRNA de forma longa poderia ser reprogramado para reprimir outros genes bacterianos, a equipe de pesquisa alterou a região espaçadora do tracrRNA de forma longa para deixá-lo assentar em um gene que produz fluorescência verde. Bactérias com esta versão mutada do tracrRNA de forma longa brilhavam menos verdes do que bactérias contendo o tracrRNA de forma longa normal, sugerindo que o tracrRNA de forma longa pode ser geneticamente modificado para reduzir outros genes bacterianos.

Os pesquisadores também descobriram os componentes genéticos do tracrRNA de forma longa em cerca de 40% do grupo de bactérias Streptococcus. Um estudo mais aprofundado de cepas bacterianas que não têm o tracrRNA de forma longa, diz Workman, irá potencialmente revelar se seus sistemas CRISPR-Cas9 estão intactos e outras maneiras pelas quais as bactérias podem retardar o sistema CRISPR-Cas9.

A capacidade do dimmer que os experimentos descobriram, diz Modell, oferece oportunidades para projetar novas ou melhores ferramentas CRISPR-Cas9 destinadas a regular a atividade do gene para fins de pesquisa. "Em um cenário de edição de genes, um pesquisador pode querer cortar um gene específico, além de usar a forma longa tracrRNA para inibir a atividade do gene", diz ele.

 

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