Seis anos atrás, Michael Niederweis, Ph.D., descreveu a primeira toxina já encontrada para o pata³geno mortal Mycobacterium tuberculosis. Esta toxina, toxina necrosante da tuberculose, ou TNT, tornou-se o membro fundador de uma nova classe de toxinas anteriormente não reconhecidas, presentes em mais de 600 espanãcies bacterianas e fúngicas, conforme determinado pela similaridade da sequaªncia de protea­nas. A toxina éliberada a  medida que a bactanãria M. tuberculosis sobrevive e cresce dentro de seu hospedeiro macra³fago humano, matando o macra³fago e permitindo a fuga e a disseminação da bactanãria.

Por 132 anos, a falta de uma toxina identificada no M. tuberculosis contrastou com quase todas as outras bactanãrias patogaªnicas cujas toxinas contribuem para a doença ou morte. O M. tuberculosis infecta 9 milhões de pessoas por ano e mata mais de 1 milha£o.

Agora, em outro trabalho inovador, o pesquisador e colegas da University of Alabama at Birmingham descrevem como duas pequenas protea­nas ESX feitas pela bactanãria M. tuberculosis medeiam a secreção de TNT pela formação de poros nas membranas que envolvem a bactanãria. Esta descoberta pode ter ampla aplicação porque um motivo distinto de três aminoa¡cidos encontrado em EsxE e EsxF - triptofano / qualquer aminoa¡cido / glicina, conhecido abreviadamente como WXG - também éencontrado em muitas outras pequenas protea­nas de micobactanãrias e no grande WXG100 superfamilia de protea­nas bacterianas que se assemelham a EsxE e EsxF.

"Aqui, mostramos pela primeira vez que pequenas protea­nas Esx da familia WXG100 tem uma função molecular importante dentro da canãlula Mtb, mediando a secreção de toxinas", disse Niederweis, professor do Departamento de Microbiologia da UAB. "Nossos resultados sugerem um mecanismo dina¢mico de formação de poros por pequenas protea­nas Esx que pode ser aplica¡vel a outros membros da grande familia de protea­nas WXG100 . Assim, nosso estudo não apenas representa um grande avanço em nossa compreensão da secreção de TNT e provavelmente de outras protea­nas em M. tuberculosis, mas também descreve uma função biológica para Esx-paralogs em M. tuberculosis e seus homa³logos na grande familia de protea­nas WXG100 em bactanãrias Gram-positivas. "

TNT éum de dois doma­nios na protea­na CpnT da membrana externa de M. tuberculosis; a atividade do doma­nio TNT de CpnT no citosol do macra³fago induz a morte do macra³fago por hidra³lise de NAD +. O M. tuberculosis possui uma membrana interna e outra externa, e uma protea­na precisa passar por cada camada para ser secretada fora da bactanãria. Nãose sabe como o CpnT chega a  membrana externa.

EsxE e EsxF são parte do mesmo segmento de gene que CpnT, e os pesquisadores da UAB levantaram a hipa³tese de que as duas pequenas protea­nas podem estar envolvidas na secreção da toxina.

Ao criar diferentes cepas sem EsxE ou EsxF, eles mostraram que ambas as protea­nas eram necessa¡rias para a translocação de CpnT para asuperfÍcie celular de M. tuberculosis e para a secreção de TNT no citosol de macra³fagos infectados com M. tuberculosis. Além disso, EsxE e EsxF são protea­nas desuperfÍcie acessa­vel em M. tuberculosis como um complexo associado a  membrana.

Para saber mais sobre o mecanismo dessa translocação, a equipe da UAB fez mutantes de cada protea­na Esx, onde o aminoa¡cido triptofano do aºnico motivo WXG em cada protea­na foi substitua­do pelo aminoa¡cido alanina. Os mutantes mostraram que um motivo WXG intacto em EsxE e em EsxF era necessa¡rio para a translocação eficiente de CpnT para a membrana externa de M. tuberculosis e subsequente secreção de TNT no citosol de macra³fagos infectados.

A purificação das protea­nas EsxE e EsxF solaºveis em águamostrou que elas formaram da­meros EsxE-EsxF, e cinco desses da­meros montados em estruturas em forma de estrela, conforme visto por microscopia eletra´nica. Cada um tinha cerca de 10 nana´metros de dia¢metro, com um poro central de 3 nana´metros.

Os experimentos com bicamadas lipa­dicas planas foram fundamentais para a compreensão da função molecular do EsxE-EsxF, pois mostraram que os poros do EsxE-EsxF formaram canais atravanãs das membranas lipa­dicas.

Finalmente, os pesquisadores mostraram que os motivos WXG eram necessa¡rios para a formação de poros e rompimento da membrana pelo complexo EsxE-EsxF, e os motivos mediados pela montagem de oliga´meros funcionais de EsxE-EsxF. Isso agora define um papel bioqua­mico para o motivo WXG anteriormente enigma¡tico.

"EsxE e EsxF constituem os primeiros componentes conhecidos da membrana externa mediando a secreção de protea­nas em M. tuberculosis", disse Niederweis. "No entanto, éimprova¡vel que EsxE e EsxF sejam suficientes para a secreção de TNT, uma vez que uma fonte de energia énecessa¡ria em todos os sistemas de secreção de protea­nas bacterianas conhecidas. Portanto, épossí­vel que EsxE-EsxF se associe a outras protea­nas ou complexos de protea­nas para alcana§ar a exportação de CpnT e secreção de TNT. "

Os pesquisadores da UAB propaµem dois modelos para o transporte de CpnT pela EsxE e EsxF. No primeiro, os heteroda­meros EsxE-EsxF formam um poro na membrana interna e, em seguida, formam outro poro na membrana externa para criar canais transmembrana. "Alternativamente", disse Niederweis, "o canal da membrana interna éestendido para abranger o periplasma atravanãs da formação de filamentos e se conecta aos poros EsxE-EsxF na membrana externa , expondo o EsxF nasuperfÍcie da canãlula. Neste modelo, o EsxE-EsxF putativo o taºnel do canal permite a exportação do polipepta­deo CpnT para a membrana externa do M. tuberculosis e a secreção subsequente de TNT e EsxE-EsxF. "

Os coautores com Niederweis no estudo "As protea­nas Esx formadoras de poros medeiam a secreção de toxinas por Mycobacterium tuberculosis ", publicado na Nature Communications , são Uday Tak e Terje Dokland, Departamento de Microbiologia da UAB.

"Este trabalho foi uma conquista nota¡vel de um aluno de graduação excepcional, Uday Tak, que fez quase todos esses experimentos sozinho", disse Niederweis. Uday Tak obteve seu Ph.D. em novembro de 2020 e agora éum pa³s-doutorado na University of Colorado-Boulder.