Em um novo recurso para a comunidade cienta­fica, publicado hoje na Nature Biotechnology, pesquisadores do laboratório de Neville Sanjana, Ph.D., do New York Genome Center (NYGC) e da New York University (NYU) desenvolveram o CRISPR-sciATAC, uma nova plataforma de triagem genanãtica integrativa que captura conjuntamente as perturbações do gene CRISPR e acessibilidade a  cromatina celular em todo o genoma. Com essa tecnologia, eles trazm o perfil dasmudanças na organização do genoma e criam um atlas em grande escala de como a perda de enzimas que alteram a cromatina individual afeta o genoma humano. O novo manãtodo aproveita a programabilidade do sistema de edição de genes CRISPR para eliminar quase todos os genes relacionados a  cromatina em paralelo, oferecendo aos pesquisadores insights mais profundos sobre o papel da acessibilidade ao DNA no câncer e em doenças raras que envolvem a cromatina.

Em uma demonstração inicial do CRISPR-sciATAC, a equipe do Sanjana Lab projetou uma biblioteca CRISPR para atingir 20 genes modificadores da cromatina que são comumente mutados em diferentes tipos de ca¢ncer, incluindo câncer de mama, ca³lon, pulma£o e cérebro. Muitas dessas enzimas atuam como supressores de tumor e sua perda resulta emmudanças globais na acessibilidade a  cromatina. Por exemplo, o grupo mostrou que a perda do gene EZH2, que codifica uma histona metitransferase, resultou em um aumento na expressão do gene em vários genes de desenvolvimento previamente silenciados.

"A escala de CRISPR-sciATAC torna este conjunto de dados muito aºnico. Aqui, em um fundo genanãtico uniforme, temos dados de acessibilidade que capturam o impacto de cada gene relacionado a  cromatina. Isso fornece um mapa detalhado entre cada gene e como sua perda afeta a organização do genoma com resolução de canãlula única ", disse a Dra. Noa Liscovitch-Brauer, pa³s-doutoranda no laboratório de Sanjana no New York Genome Center e na NYU e coautora do estudo.

No total, a equipe teve como alvo mais de 100 genes relacionados a  cromatina e desenvolveu um "atlas da cromatina" que mapeia como o genoma muda em resposta a  perda dessas protea­nas. O atlas mostra que diferentes subunidades dentro de cada um dos 17 complexos de remodelação da cromatina direcionados podem ter efeitos diferentes na acessibilidade do genoma. Surpreendentemente, quase todos esses complexos tem subunidades onde a perda desencadeia maior acessibilidade e outras subunidades com o efeito oposto. No geral, a maior interrupção nos locais de ligação do fator de transcrição, que são elementos funcionais importantes no genoma, foi observada após a perda da protea­na 1A contendo o doma­nio interativo rico em AT ( ARID1A), um membro do complexo BAF. Estima-se que mutações nas protea­nas do complexo BAF estejam envolvidas em 1 em cada 5 ca¢nceres.

Além do manãtodo CRISPR-sciATAC, a equipe também desenvolveu um conjunto de manãtodos computacionais para mapear os movimentos dina¢micos dos nucleossomos, que são os aglomerados de protea­nas que o DNA envolve. Quando hámais nucleossomos, o DNA éfortemente enrolado e menos dispona­vel para ligar os fatores de transcrição. Isso éexatamente o que a equipe encontrou em locais de ligação de fator de transcrição específicos envolvidos na proliferação celular após o knock-out de CRISPR de ARID1A. Ao alvejar uma enzima modificadora da cromatina diferente, esses mesmos locais sofreram uma expansão no espaa§amento dos nucleossomos, demonstrando a dina¢mica do posicionamento dos nucleossomos em locais específicos do genoma. O manãtodo CRISPR-sciATAC permitiu a  equipe explorar sistematicamente esta plasticidade do genoma para maºltiplas enzimas modificadoras da cromatina e sa­tios de ligação do fator de transcrição.

"Na³s realmente nos concentramos em tornar CRISPR-sciATAC uma técnica acessa­vel - quera­amos que fosse algo que qualquer laboratório pudesse fazer. Produzimos a maioria das principais enzimas internamente e usamos manãtodos simples para o isolamento de uma única canãlula que não requerem microflua­dicos ou kits de canãlula única ", disse o Dr. Antonino Montalbano, ex-pa³s-doutorando no laboratório de Sanjana no New York Genome Center e na NYU e coautor do estudo.

Para desenvolver a tecnologia CRISPR-sciATAC, os pesquisadores usaram uma mistura de células humanas e de camundongo para criar um processo de marcação / identificação que lhes permitiu dividir e codificar os núcleos das células, bem como capturar os RNAs de guia aºnico necessa¡rios para o direcionamento CRISPR. O trabalho baseia-se no trabalho anterior de indexação combinata³ria de canãlula única ATAC-seq (sciATAC-seq) do Dr. Jay Shendure da Universidade de Washington e outros grupos que desenvolvem novos manãtodos gena´micos de canãlula única. O CRISPR-sciATAC também usa uma transposase única e fa¡cil de purificar que foi desenvolvida no Laborata³rio de Tecnologia de Inovação de NYGC. Um grande obsta¡culo tanãcnico foi otimizar as condições experimentais para capturar simultaneamente os RNAs guia CRISPR e fragmentos do genoma para o perfil de acessibilidade, mantendo o envelope nuclear de cada canãlula intacta.

"Integrando o perfil de acessibilidade da cromatina ao genoma. As telas CRISPR em toda a extensão fornecem uma nova lente para entendermos a regulação do gene ", disse o Dr. Sanjana, membro do corpo docente do NYGC, professor assistente de biologia, NYU e professor assistente de Neurociênciae fisiologia, NYU Grossman School of Medicine, o estudo autor saªnior. "Com o CRISPR-sciATAC, temos uma visão abrangente de como enzimas e complexos modificadores da cromatina específicos mudam a acessibilidade e orquestram as interações que controlam a expressão gaªnica. A cromatina prepara o terreno para a expressão gaªnica, e aqui podemos medir o impacto de diferentes mutações na cromatina rapidamente. Esperamos que este atlas seja um recurso amplamente útil para a comunidade e que o CRISPR-sciATAC seja usado para produzir atlas semelhantes em outros sistemas biola³gicos e contextos de doena§as. "