Com a variante Delta causando estragos em populações não vacinadas, a capacidade de diagnosticar rapidamente e rastrear variantes emergentes do va­rus écrucial. Os pesquisadores agora criaram um teste de diagnóstico simples e barato baseado em CRISPR que permite que os usuários testem a si mesmos para maºltiplas variantes do va­rus SARS-CoV-2 em casa, usando apenas uma amostra de sua saliva.

Desenvolvido por pesquisadores do Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering da Harvard University, do Massachusetts Institute of Technology e de vários hospitais da área de Boston, o dispositivo de diagnóstico, denominado SHERLOCK Minimally Instrumented (miSHERLOCK), éfa¡cil de usar e fornece resultados que podem ser lido e verificado por um aplicativo de smartphone que o acompanha dentro de uma hora.

miSHERLOCK distinguiu com sucesso entre três variantes diferentes de SARS-CoV-2 em experimentos e pode ser reconfigurado rapidamente para detectar variantes adicionais como Delta. O dispositivo pode ser montado usando uma impressora 3D e componentes comumente disponí­veis por cerca de US $ 15, e a reutilização do hardware reduz o custo dos ensaios individuais para US $ 6 cada.

“MiSHERLOCK elimina a necessidade de transportar amostras de pacientes para um local de teste centralizado e simplifica muito as etapas de preparação de amostras, dando aos pacientes e médicos uma imagem mais rápida e precisa da saúde individual e da comunidade, o que écrítico durante uma pandemia em evolução”, disse co- primeira autora Helena de Puig , pa³s-doutoranda no Wyss Institute e no MIT.

O dispositivo de diagnóstico édescrito em um artigo publicado hoje na Science Advances .

Como instrutora de pediatria no Boston Children's Hospital com especialização em doenças infecciosas, a co-autora Rose Lee tem trabalhado na linha de frente da pandemia COVID-19 por mais de um ano. Suas experiências na cla­nica forneceram inspiração para o projeto que viria a se tornar miSHERLOCK.

“Coisas simples que costumavam ser onipresentes no hospital, como esfregaa§os de nasofaringe, de repente ficaram difa­ceis de conseguir, então os procedimentos de processamento de amostra de rotina foram interrompidos, o que éum grande problema em um cena¡rio de pandemia”, disse Lee, que também évisitante no Wyss Institute. “A motivação de nossa equipe para este projeto foi eliminar esses gargalos e fornecer diagnósticos precisos para COVID-19 com menos dependaªncia de cadeias de suprimentos globais e também detectar com precisão as variantes que estavam comea§ando a surgir.”

Para a pea§a de detecção de SARS-CoV-2 de seu diagnóstico, o grupo recorreu a uma tecnologia baseada em CRISPR criada no laboratório do membro do corpo docente Wyss Core e autor saªnior do artigo Jim Collins, chamada de "desbloqueio de repa³rter enzima¡tico especa­fico de alta sensibilidade" (SHERLOCK) . O SHERLOCK usa a "tesoura molecular" do CRISPR para cortar DNA ou RNA em locais específicos, com um ba´nus adicional: este tipo especa­fico de tesoura também corta outros pedaço s de DNA na área circundante, permitindo que seja projetada com moléculas de sonda de a¡cido nucleico para produza um sinal indicando que o alvo foi cortado com sucesso.

Os pesquisadores criaram uma reação SHERLOCK projetada para cortar o RNA do SARS-CoV-2 em uma regia£o especa­fica de um gene chamado Nucleoprotea­na, que éconservado em maºltiplas variantes do va­rus. Quando a tesoura molecular - uma enzima chamada Cas12a - se liga e corta com sucesso o gene da nucleoprotea­na, as sondas de DNA de fita simples também são cortadas, produzindo um sinal fluorescente. Eles também criaram ensaios SHERLOCK adicionais projetados para direcionar um painel de mutações virais nas sequaªncias da protea­na Spike que representam três variantes genanãticas do SARS-CoV-2: Alfa, Beta e Gama.

Armada com ensaios que pudessem detectar com segurança o RNA viral dentro da faixa de concentração aceita para testes diagnósticos autorizados pela FDA, a equipe a seguir concentrou seus esforços em resolver o que éindiscutivelmente o desafio mais difa­cil em diagnósticos: a preparação de amostras.

A equipe optou por usar saliva em vez de amostras de swab nasofara­ngeo como manãtodo de coleta, porque émais fa¡cil para os usuários coletarem saliva e os estudos mostraram que o SARS-CoV-2 édetecta¡vel na saliva por um número maior de dias após a infecção. Mas a saliva não processada apresenta seus pra³prios desafios: ela contanãm enzimas que degradam várias molanãculas, produzindo uma alta taxa de falsos positivos.

Os pesquisadores desenvolveram uma nova técnica para resolver esse problema. Primeiro, eles adicionaram dois produtos químicos chamados DTT e EGTA a  saliva e aqueceram a amostra a 95 ° C por 3 minutos, o que eliminou o sinal falso-positivo da saliva não tratada e cortou todas aspartículas virais. Eles então incorporaram uma membrana porosa que foi projetada para prender o RNA em suasuperfÍcie, que poderia finalmente ser adicionada diretamente a  reação SHERLOCK para gerar um resultado.

Para integrar a preparação da amostra de saliva e a reação SHERLOCK em um diagnóstico, a equipe projetou um dispositivo simples alimentado por bateria com duas ca¢maras: uma ca¢mara de preparação de amostra aquecida e uma ca¢mara de reação não aquecida. Um usua¡rio cospe na ca¢mara de preparação de amostra, liga o aquecedor e espera de três a seis minutos para que a saliva penetre no filtro. O usua¡rio remove o filtro e o transfere para a coluna da ca¢mara de reação, então empurra um aªmbolo que deposita o filtro na ca¢mara e perfura um reservata³rio de águapara ativar a reação SHERLOCK. Cinquenta e cinco minutos depois, o usua¡rio olha pela janela do transiluminador colorido para a ca¢mara de reação e confirma a presença de um sinal fluorescente.

Os pesquisadores testaram seu dispositivo de diagnóstico usando amostras cla­nicas de saliva de 27 pacientes com COVID-19 e 21 pacientes sauda¡veis, e descobriram que miSHERLOCK identificou corretamente pacientes positivos para COVID-19 96 por cento das vezes e pacientes sem a doença em 95 por cento das vezes. Eles também testaram seu desempenho contra as variantes Alfa, Beta e Gama SARS-CoV-2, adicionando saliva humana sauda¡vel com RNA viral sintanãtico completo contendo mutações que representam cada variante e descobriram que o dispositivo foi eficaz em uma variedade de RNA viral concentrações.

“Uma das melhores coisas sobre miSHERLOCK éque ele étotalmente modular. O pra³prio dispositivo éseparado dos ensaios, então vocêpode conectar diferentes ensaios para a sequaªncia especa­fica de RNA ou DNA que estãotentando detectar ”, disse a coautora Devora Najjar , assistente de pesquisa do MIT Media Lab e em o Laborata³rio Collins. “Os ensaios para novos alvos podem ser criados em cerca de duas semanas, permitindo o rápido desenvolvimento de testes para novas variantes do COVID-19 e outras doena§as.”

A equipe miSHERLOCK criou seu dispositivo com configurações de poucos recursos em mente, pois a pandemia trouxe a  luz as vastas desigualdades no acesso aos cuidados de saúde que existem entre as diferentes partes do mundo.

“Quando o projeto miSHERLOCK começou, quase não havia monitoramento da variante SARS-CoV-2 acontecendo. Saba­amos que o rastreamento de variantes seria extremamente importante ao avaliar os efeitos de longo prazo do COVID-19 nas comunidades locais e globais, então nos esforçamos para criar uma plataforma de diagnóstico verdadeiramente descentralizada, flexa­vel e fa¡cil de usar ”, disse Collins, que também éo professor Termeer de Engenharia Manãdica e Ciências do MIT. “Ao resolver o problema de preparação da amostra, garantimos que este dispositivo estãovirtualmente pronto para os consumidores usarem como estãoe estamos entusiasmados em trabalhar com parceiros industriais para disponibiliza¡-lo comercialmente.”