O genoma humano contém cerca de 23 mil genes, mas apenas uma fração desses genes está ativada dentro de uma célula em um determinado momento. A complexa rede de elementos reguladores que controla a expressão genética inclui regiões do genoma chamadas intensificadores, que muitas vezes estão localizadas longe dos genes que regulam.

Esta distância pode dificultar o mapeamento das interações complexas entre genes e potenciadores. Para superar isso, os pesquisadores do MIT inventaram uma nova técnica que lhes permite observar o momento da ativação do gene e do intensificador em uma célula. Quando um gene é ativado ao mesmo tempo que um intensificador específico, isso sugere fortemente que o intensificador está controlando esse gene.

Aprender mais sobre quais intensificadores controlam quais genes, em diferentes tipos de células, poderia ajudar os pesquisadores a identificar potenciais alvos de medicamentos para doenças genéticas. Estudos genômicos identificaram mutações em muitas regiões não codificadoras de proteínas que estão ligadas a uma variedade de doenças. Poderiam ser potenciadores desconhecidos?

“Quando as pessoas começam a usar a tecnologia genética para identificar regiões dos cromossomos que contêm informações sobre doenças, a maioria desses locais não corresponde aos genes. Suspeitamos que correspondem a estes potenciadores, que podem estar bastante distantes de um promotor, por isso é muito importante ser capaz de identificar estes potenciadores”, afirma Phillip Sharp, professor emérito do Instituto MIT e membro do Instituto Koch para Investigação Integrativa do Cancro do MIT.

Sharp é o autor sênior do novo estudo, publicado hoje na Nature . O assistente de pesquisa do MIT, DB Jay Mahat, é o principal autor do artigo.

Menos de 2% do genoma humano consiste em genes codificadores de proteínas. O resto do genoma inclui muitos elementos que controlam quando e como esses genes são expressos. Os intensificadores, que se acredita ativarem os genes ao entrarem em contato físico com regiões promotoras de genes através da formação transitória de um complexo, foram descobertos há cerca de 45 anos.

Mais recentemente, em 2010, os investigadores descobriram que estes potenciadores são transcritos em moléculas de ARN, conhecidas como ARN potenciador ou eRNA. Os cientistas suspeitam que esta transcrição ocorre quando os potenciadores estão interagindo ativamente com os seus genes alvo. Isto levantou a possibilidade de que a medição dos níveis de transcrição de eRNA pudesse ajudar os pesquisadores a determinar quando um intensificador está ativo, bem como quais genes ele tem como alvo.

“Essa informação é extraordinariamente importante para a compreensão de como ocorre o desenvolvimento e para a compreensão de como os cancros alteram os seus programas reguladores e ativam processos que levam à desdiferenciação e ao crescimento metastático”, diz Mahat.

No entanto, este tipo de mapeamento tem-se revelado difícil de realizar porque o eRNA é produzido em quantidades muito pequenas e não dura muito tempo na célula. Além disso, o eRNA carece de uma modificação conhecida como cauda poli-A, que é o “gancho” que a maioria das técnicas usa para puxar o RNA para fora de uma célula.

Uma maneira de capturar o eRNA é adicionar um nucleotídeo às células que interrompe a transcrição quando incorporado ao RNA. Esses nucleotídeos também contêm uma etiqueta chamada biotina que pode ser usada para pescar o RNA de uma célula. No entanto, esta técnica atual só funciona em grandes conjuntos de células e não fornece informações sobre células individuais.

Enquanto discutiam ideias para novas maneiras de capturar eRNA, Mahat e Sharp consideraram o uso da química de cliques, uma técnica que pode ser usada para unir duas moléculas se cada uma delas estiver marcada com “alças de clique” que possam reagir juntas.

Os pesquisadores projetaram nucleotídeos marcados com uma alça de clique e, uma vez que esses nucleotídeos são incorporados às cadeias de eRNA em crescimento, as cadeias podem ser pescadas com uma etiqueta contendo a alça complementar. Isso permitiu aos pesquisadores capturar o eRNA e depois purificá-lo, amplificá-lo e sequenciá-lo. Algum RNA é perdido em cada etapa, mas Mahat estima que eles possam extrair com sucesso cerca de 10% do eRNA de uma determinada célula.

Usando esta técnica, os pesquisadores obtiveram um instantâneo dos intensificadores e genes que estão sendo transcritos ativamente em um determinado momento em uma célula.

“Queremos poder determinar, em cada célula, a ativação da transcrição a partir de elementos reguladores e do gene correspondente. E isso tem que ser feito em uma única célula porque é onde você pode detectar sincronia ou assincronia entre elementos reguladores e genes”, diz Mahat.

Demonstrando sua técnica em células-tronco embrionárias de camundongos, os pesquisadores descobriram que poderiam calcular aproximadamente quando uma determinada região começa a ser transcrita, com base no comprimento da fita de RNA e na velocidade da polimerase (a enzima responsável pela transcrição) — isto é, , até que ponto a polimerase transcreve por segundo. Isso lhes permitiu determinar quais genes e intensificadores estavam sendo transcritos ao mesmo tempo.

Os pesquisadores usaram essa abordagem para determinar o momento da expressão dos genes do ciclo celular com mais detalhes do que era possível anteriormente. Eles também foram capazes de confirmar vários conjuntos de pares de genes intensificadores conhecidos e geraram uma lista de cerca de 50.000 possíveis pares de genes intensificadores que agora podem tentar verificar.

Aprender quais intensificadores controlam quais genes seria valioso no desenvolvimento de novos tratamentos para doenças com base genética. No ano passado, a Food and Drug Administration dos EUA aprovou o primeiro tratamento de terapia genética para a anemia falciforme, que funciona interferindo com um intensificador que resulta na ativação de um gene da globina fetal, reduzindo a produção de células sanguíneas falciformes.

A equipa do MIT está agora a aplicar esta abordagem a outros tipos de células, com foco em doenças autoimunes. Trabalhando com investigadores do Hospital Infantil de Boston, estão a explorar mutações nas células imunitárias que têm sido associadas ao lúpus, muitas das quais são encontradas em regiões não codificadas do genoma.

“Não está claro quais genes são afetados por essas mutações, por isso estamos começando a separar os genes que esses supostos intensificadores podem estar regulando e em quais tipos de células esses intensificadores estão ativos”, diz Mahat. “Esta é uma ferramenta para criar mapas de genes para intensificadores, que são fundamentais para a compreensão da biologia, e também uma base para a compreensão das doenças.”

As descobertas deste estudo também oferecem evidências para uma teoria que Sharp desenvolveu recentemente, juntamente com os professores do MIT Richard Young e Arup Chakraborty, de que a transcrição genética é controlada por gotículas sem membrana conhecidas como condensadas. Esses condensados são feitos de grandes aglomerados de enzimas e RNA, que Sharp sugere que podem incluir eRNA produzido em locais intensificadores.

“Imaginamos que a comunicação entre um potenciador e um promotor é uma estrutura transitória, do tipo condensado, e o RNA faz parte disso. Este é um trabalho importante na construção da compreensão de como os RNAs dos intensificadores podem ser ativos”, diz ele.

A pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional do Câncer, pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Prêmio de Transição de Pós-Doutorado da Emerald Foundation.