Os va­rus são os cavalos de Tra³ia da natureza: eles ganham acesso a s células, contrabandeiam seu material genanãtico e usam o pra³prio mecanismo da canãlula para se replicar. Durante décadas, os cientistas estudaram como minimizar seus efeitos deletanãrios e atéredirecionar esses invasores para fornecer não seu pra³prio genoma viral, mas terapaªuticas para o tratamento de doenças e ferramentas para o estudo de células. Para ser eficaz nesses novos papanãis, no entanto, cada va­rus deve agir com segurança, eficiência e seletividade nas células em que sua carga genanãtica édesejada. Essa éuma tarefa para a qual o repertório natural de va­rus estãomal equipado.

Os pesquisadores da Caltech agora desenvolveram um manãtodo para identificar rápida e eficientemente variantes de va­rus adeno-associado (AAV) que podem fornecer ou "transduzir" tipos específicos de células em ratos, permitindo que os cientistas escolham um va­rus com base em pesquisas ou necessidades cla­nicas. Os AAVs naturais são um ponto de partida particularmente promissor para este trabalho, pois o va­rus não tem associação conhecida com a doena§a, apesar de sua ampla prevalaªncia em populações humanas, não provoca uma forte resposta imune e não pode se reproduzir por conta própria. Sripriya Ravindra Kumar, estudante de Caltech, éo primeiro autor de um artigo sobre a pesquisa publicada na edição de maio da revista Nature Methods .

O trabalho foi conduzido no laboratório de Viviana Gradinaru (BS '05), professora de Neurociênciae engenharia biológica do Heritage Medical Research Institute Investigator e diretora do Centro de Neurociaªncia Molecular e Celular do Instituto de Neurociaªncia Tianqiao e Chrissy Chen da Caltech. .

"Se vocêpode reprojetar um va­rus para entregar mensagens genanãticas que podem se traduzir em uma protea­na de interesse terapaªutico, pode tratar uma doença na fonte celular", diz Ravindra Kumar. "Ainda resta muito trabalho para entender doenças nonívelcelular. A boa nota­cia éque esses va­rus podem ser utilizados pela comunidade cienta­fica em geral para estudar células e associações de doena§as".

Todos os va­rus tem o mesmo design fundamental: são pedaço s de material genanãtico, RNA ou DNA, protegidos por uma concha chamada capsa­deo. A química dasuperfÍcie de um capsa­deo do AAV pode influenciar sua capacidade de se prender a uma protea­na da membrana celular, permitindo a entrada em uma canãlula. Nos va­rus naturais, os capsa­deos foram desenvolvidos para se prenderem a s protea­nas presentes nassuperfÍcies de muitos tecidos ou populações celulares. No entanto, para torna¡-los aºteis para fornecer terapaªutica apenas a s células que precisam delas, os bioengenheiros trabalham para projetar capsa­deos que permitem a entrada em tipos específicos de células. Isso épossí­vel se os capsa­deos projetados puderem se prender a s protea­nas da membrana encontradas exclusivamente em um tipo de canãlula e não em outras.

Para esse fim, o laboratório Gradinaru tem trabalhado para montar um cata¡logo de vetores virais para diferentes tipos de células e usos, recrutando o poder da evolução direcionada para pesquisar milhões de variantes do capsa­deo AAV em um aºnico hospedeiro. No novo trabalho, Ravindra Kumar e seus colaboradores desenvolveram um manãtodo chamado M-CREA (evolução direcionada ao AAV baseado em recombinação Multiplexed Cre). Esse manãtodo rastreia rapidamente grandes bibliotecas de capsa­deos de AAV, cada uma decorada de maneira exclusiva com um novo loop desuperfÍcie, para obter interações com diferentes protea­nas celulares e, assim, inserir tipos específicos de células em camundongos.

"Agora, mostramos pelo M-CREATE que os AAVs podem ser projetados para a especificidade do tipo de canãlula apenas pelo capsa­deo, eliminando a necessidade de elementos reguladores genanãticos para alcana§ar especificidade e, portanto, liberando espaço crucial no pequeno capsa­deo do AAV para o material genanãtico necessa¡rio". diz Gradinaru.

O trabalho baseia-se em um manãtodo anterior desenvolvido no laboratório Gradinaru. Em 2016, o grupo determinou como projetar um AAV para atravessar a barreira hematoencefa¡lica (BBB), uma camada de células fortemente compactada que normalmente impede que va­rus circulantes e outros patógenos entrem no cérebro e na medula espinhal. Os vetores virais modificados agora podem ser administrados atravanãs de uma injeção sistemica intravenosa simples, permitindo que os pesquisadores evitem injeções invasivas no cérebro, e foram amplamente adotados como ferramentas de pesquisa. No entanto, o processo de triagem anterior exigiu muito tempo e trabalho, identificou apenas um punhado de capsa­deos e não pa´de acomodar telas em vários alvos necessa¡rios para descobrir a especificidade do capsa­deo para vários tecidos e, em seguida, os diversos tipos de células dentro desses tecidos.

Fundamentalmente, o M-CREATE fornece não apenas um capsa­deo "vencedor" para que a competição transduza um tipo de canãlula, mas uma espanãcie de pa³dio do finalizador, classificando a aptida£o de milhares de outras variantes de capsa­deo ao mesmo tempo. Essa melhoria permitiu a  equipe identificar novos capsa­deos que, ao serem entregues na corrente sanguínea, preferencialmente transduzem neura´nios no cérebro ou células vasculares que formam a barreira hematoencefa¡lica. "Ferramentas de engenharia de entrega de genes que visam especificamente células cerebrais neuronais e não neuronais relevantes para a doena§a, como as células endoteliais cerebrais que compreendem a vasculatura e a BBB, podem permitir pesquisas de mudança de paradigma, por exemplo, neurodegeneração ou derrame", diz Gradinaru. "Como uma BBB prejudicada pode permitir fatores patola³gicos no cérebro que iniciam e / ou aceleram a neurodegeneração, visando funcionalmente a permeabilidade da BBB atravanãs de AAVs projetados pode afetar o acesso corpo-cérebro atravanãs da circulação. Isso nos permitira¡ reparar uma barreira enfraquecida na doença ou, inversamente, permeabilizar temporariamente a BBB sauda¡vel, se necessa¡rio, com o objetivo de fornecer terapias ao cérebro pela corrente sanguínea ".

Ravindra Kumar e colaboradores também identificaram muitos capsa­deos do AAV que atravessam a barreira hematoencefa¡lica com eficiência semelhante, apesar de terem sequaªncias altamente distintas projetadas no capsa­deo. Ao contra¡rio dos AAVs projetados anteriormente, que exibiam alguma especificidade de deformação, os novos capsa­deos funcionam igualmente bem em linhagens de ratos testadas com perfis BBB distintos. "Isso sugere que os novos capsa­deos projetados podem atravessar a barreira hematoencefa¡lica por meio de interações com protea­nas desuperfÍcie exclusivas. A identificação de diversos mecanismos de ação para acessar o mesmo tecido pode ser crucial para a tradução dessas ferramentas de ratos para outros organismos modelo, incluindo seres humanos, "diz Timothy F. Miles, diretor cienta­fico do CLOVER Center do Beckman Institute e segundo autor do estudo.

"O que éemocionante no M-CREATE éo seu potencial para identificar diversos capsa­deos com estruturas desuperfÍcie únicas que resolvem o mesmo problema, como atravessar a barreira hematoencefa¡lica, de diferentes maneiras. As aplicações potenciais são numerosas, desde a entrega de genes terapaªuticos aos animais modelos de doença para aprender mais sobre as diferenças nos receptores dasuperfÍcie celular e a composição do BBB entre cepas e espanãcies ". diz Gradinaru.

O artigo éintitulado "A seleção dependente de Cre multiplexada produz AAVs sistemicos para atingir diferentes tipos de células cerebrais".Além de Ravindra Kumar, Miles e Gradinaru, os co-autores da Caltech são estudantes de graduação Xinhong Chen, David Brown, Tatyana Dobreva, Xiaozhe Ding e Yicheng Luo; o ex-cientista da equipe Qin Huang agora do Broad Institute; O aluno do SURF Panãtur Einarsson; o ex-colega de pa³s-doutorado Alon Greenbaum agora da North Carolina State University e da University of North Carolina em Chapel Hill; pa³s-doutorado Min Jang; e Benjamin Deverman, ex-diretor do CLOVER Center, agora do Broad Institute. O financiamento foi concedido por doações a Gradinaru pelos Institutos Nacionais de Saúde, Fundação Vallee, Fundação Moore, Rede de Desafio de Neurodegeneração CZI, Fundação Nacional de Ciência, Instituto de Pesquisa Manãdica Heritage e Instituto de Pesquisa Manãdica Heritage e Instituto Beckman de CLARITY, Optogenanãtica e Engenharia de Vetor Pesquisa (CLOVER).