Tecnologia Científica

A origem das coisas
Esporos microbianos com código de barra de DNA podem rastrear a origem de objetos, produtos agrícolas
Por Kevin Jiang - 05/06/2020

Alex Wigan / Unsplash

Todos os anos, estima-se que 48 milhões de americanos adoecem por doenças transmitidas por alimentos, resultando em cerca de 128.000 hospitalizações e 3.000 mortes, de acordo com os Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. Esse problema de saúde pública é composto por bilhões de danos econômicos causados ​​por recalls de produtos, destacando a necessidade de determinar com rapidez e precisão as fontes de doenças transmitidas por alimentos.

Com a crescente complexidade das cadeias globais de suprimentos para os inúmeros alimentos disponíveis para os consumidores, no entanto, a tarefa de rastrear a origem exata dos itens contaminados pode ser difícil.

Em uma solução inovadora que pode ajudar a determinar a origem de produtos agrícolas e outros bens, os cientistas da Harvard Medical School (HMS) desenvolveram um sistema microbiano com código de barra de DNA que pode ser usado para rotular objetos de maneira barata, escalável e confiável.

Um frasco de esporos com código de barras de DNA.
Fotos cortesia de Jason Qian

Relatando na Science em 4 de junho, a equipe de pesquisa descreve como os esporos microbianos sintéticos podem ser introduzidos com segurança em objetos e superfícies em um ponto de origem, como um campo ou fábrica, e ser detectados e identificados meses depois.

Os esporos são derivados do fermento de padeiro e de uma cepa bacteriana comum usada em uma ampla variedade de aplicações, como suplementos alimentares probióticos, e projetados para serem incapazes de crescer na natureza para evitar efeitos ecológicos adversos.

“Os esporos são, sob muitos aspectos, uma solução antiga e foram pulverizados com segurança em produtos agrícolas como inoculantes do solo ou pesticidas biológicos por décadas. Acabamos de adicionar uma pequena sequência de DNA que podemos amplificar e detectar ”, disse o autor do estudo, Michael Springer , professor associado de biologia de sistemas no Instituto Blavatnik do HMS.

"Também trabalhamos duro para garantir que esse sistema seja seguro, usando cepas microbianas comuns e construindo em vários níveis de controle", acrescentou Springer. "Esperamos que possa ser usado para ajudar a resolver problemas que têm enormes implicações econômicas e de saúde pública".

Nos últimos anos, os cientistas aprenderam muito sobre as interações entre micróbios e seus ambientes. Estudos mostram que comunidades microbianas em residências , telefones celulares , corpos humanos e mais têm composições únicas, semelhantes às impressões digitais. As tentativas de usar impressões digitais microbianas para identificar a proveniência podem consumir muito tempo e não são facilmente dimensionadas.

O uso de seqüências de DNA sintetizadas como códigos de barras mostrou-se, em princípio, eficaz para rotular alimentos e outros itens. Para serem amplamente úteis, os códigos de barras do DNA devem ser produzidos de forma barata em grandes volumes, persistir em objetos em ambientes altamente variáveis ​​e capazes de serem decodificados de maneira confiável e rápida - obstáculos que até agora não foram superados porque o DNA é frágil.


Embalagem resistente

Em seu estudo, Springer e colegas decidiram determinar se códigos de barras de DNA embalados em esporos microbianos, que podem ser pulverizados nas plantações e identificados meses depois, poderiam ajudar a resolver esses desafios.

Muitos microorganismos, incluindo bactérias, leveduras e algas, formam esporos em resposta a condições ambientais adversas. Analogamente às sementes, os esporos permitem que os microrganismos permaneçam inativos por períodos extraordinariamente longos e sobrevivam a condições extremas, como altas temperaturas, secas e radiação UV.

A equipe de pesquisa criou sequências de DNA personalizadas que foram integradas aos genomas dos esporos de dois microorganismos - Saccharomyces cerevisiae , também conhecida como levedura de padeiro, e Bacillus subtilis, uma bactéria comum que tem vários usos comerciais, incluindo probióticos alimentares, um inoculante do solo e um agente fermentador em certos alimentos. Esses esporos podem ser cultivados mais barato em laboratório em grandes números.

As sequências sintéticas de DNA são curtas e não codificam nenhum produto proteico e, portanto, são biologicamente inertes. Inseridas no genoma em conjunto, as sequências são projetadas para que bilhões de códigos de barras exclusivos possam ser criados.

A equipe também garantiu que os esporos com código de barra de DNA não pudessem se multiplicar, crescer e se espalhar na natureza. Eles o fizeram usando cepas microbianas que requerem suplementação nutricional específica e excluindo genes necessários para que os esporos germinem e cresçam. Experimentos envolvendo de centenas de milhões a mais de um trilhão de esporos modificados confirmaram que eles são incapazes de formar colônias.

Para ler os códigos de barras do DNA, os pesquisadores usaram uma ferramenta barata baseada em CRISPR que pode detectar a presença de um alvo genético rapidamente e com alta sensibilidade. A tecnologia, chamada SHERLOCK , foi desenvolvida no Broad Institute of MIT e Harvard, em uma colaboração liderada pelos membros do instituto James Collins e Feng Zhang.

"Os esporos podem sobreviver na natureza por um tempo extremamente longo e são um ótimo meio para incorporar códigos de barras de DNA", disse o co-primeiro autor do estudo Jason Qian , estudante de biologia de sistemas do HMS. “A identificação dos códigos de barras é direta, usando uma fonte de luz azul, um filtro de plástico laranja e uma câmera de celular. Não prevemos nenhum desafio para a implantação em campo. ”


 Mundo real

A equipe examinou a eficácia de seu sistema de esporos microbianos com código de barras através de uma variedade de experimentos.

Eles cultivaram plantas em laboratório e pulverizaram cada planta com diferentes esporos com código de barras. Uma semana após a inoculação, uma folha e uma amostra de solo de cada vaso foram colhidas. Os esporos foram facilmente detectados e, mesmo quando as folhas foram misturadas, a equipe conseguiu identificar de qual vaso cada folha veio.

Quando pulverizados na grama do lado de fora e expostos ao clima natural por vários meses, os esporos permaneceram detectáveis, com dispersão mínima fora da região inoculada. Em ambientes como areia, solo, carpete e madeira, os esporos sobreviveram por meses sem perda ao longo do tempo e foram identificados após distúrbios como aspirar, varrer e simular vento e chuva.

É provável que os esporos persistam nas condições de uma cadeia de suprimentos do mundo real, de acordo com os pesquisadores. Como prova de princípio, eles testaram dezenas de itens comprados em lojas quanto à presença de esporos de Bacillus thuringiensis (Bt) , uma espécie bacteriana amplamente usada como pesticida. Eles identificou corretamente todos os Bt -positivo e Bt plantas -negative.

Em experimentos adicionais, a equipe construiu uma caixa de areia interna de 100 metros quadrados e descobriu que a propagação de esporos era mínima após meses simulados de vento, chuva e distúrbios físicos.

Eles também confirmaram que os esporos podem ser transferidos para objetos do ambiente. Os esporos foram facilmente identificados nos sapatos das pessoas que caminhavam pela caixa de areia, mesmo depois de caminhar por várias horas em superfícies que nunca foram expostas aos esporos. No entanto, os esporos não puderam ser detectados nessas superfícies, sugerindo que os objetos os retenham sem propagação significativa.

Essa característica, observou a equipe, pode permitir que esporos sejam usados ​​para determinar se um objeto passou por uma área inoculada. Eles testaram isso dividindo a caixa de areia em grades, cada uma rotulada com até quatro esporos com código de barras diferentes. Indivíduos e um carro de controle remoto navegavam na caixa de areia.

Eles descobriram que podiam identificar as grades específicas pelas quais os objetos passavam com o mínimo de falsos positivos ou negativos, sugerindo uma possível aplicação como uma ferramenta complementar para forense ou aplicação da lei.

A equipe também considerou possíveis implicações de privacidade, observando que tecnologias existentes, como corantes UV, rastreamento de telefones celulares e reconhecimento facial, já são amplamente utilizadas, mas permanecem controversas.

"Como cientistas, nossa responsabilidade é resolver desafios científicos, mas, ao mesmo tempo, queremos ter certeza de que reconhecemos implicações sociais mais amplas", disse Springer. "Acreditamos que os esporos com código de barras são mais adequados para aplicações agrícolas e industriais e seriam ineficazes para a vigilância humana".

Independentemente disso, o uso e a adoção dessa tecnologia devem ser feitos considerando as questões de ética e privacidade, disseram os autores do estudo.

Os pesquisadores agora estão explorando maneiras de melhorar o sistema, incluindo a engenharia de potenciais mecanismos de interrupção de interrupção nos esporos, encontrando maneiras de limitar a propagação e examinando se os esporos podem ser usados ​​para fornecer informações temporais sobre o histórico de localização.

"Surtos de patógenos prejudiciais transmitidos por alimentos, como listeria , salmonela e E. coli, ocorrem de forma natural e frequente", disse Springer. "Ferramentas simples e seguras de biologia sintética e conhecimento de biologia básica nos permitem criar coisas que têm muito potencial na solução de problemas de segurança do mundo real".

Os autores co-primeiros do estudo incluem Zhi-xiang Lu, Christopher Mancuso, Han-Ying Jhuang,

Rocío del Carmen Barajas-Ornelas e Sarah Boswell.

Autores adicionais incluem Fernando Ramírez-Guadiana, Victoria Jones, Akhila Sonti, Kole Sedlack, Lior Artzi, Giyoung Jung, Mohammad Arammash, Mary Pettit, Michael Melfi, Lorena Lyon, Siân Owen, Michael Baym, Ahmad Khalil, Pamela Silver e David Rudner. .

Este trabalho foi apoiado pela robustez biológica da DARPA em configurações complexas (concessão HR001117S0029).

 

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