Tecnologia Científica

Método de imagem revela uma sinfonia de atividades celulares
A técnica de imagem fluorescente captura simultaneamente diferentes tipos de sinais de vários locais em uma célula viva.
Por Anne Trafton - 27/11/2020


Os pesquisadores do MIT desenvolveram uma forma de gerar imagens simultaneamente de até cinco moléculas diferentes dentro de uma célula, direcionando repórteres brilhantes para locais distintos dentro da célula. Essa abordagem pode permitir que os cientistas aprendam muito mais sobre as complexas redes de sinalização que controlam a maioria das funções celulares. Créditos:Cortesia dos pesquisadores

Dentro de uma única célula, milhares de moléculas, como proteínas, íons e outras moléculas de sinalização, trabalham juntas para realizar todos os tipos de funções - absorção de nutrientes, armazenamento de memórias e diferenciação em tecidos específicos, entre muitas outras.

Decifrar essas moléculas e todas as suas interações é uma tarefa monumental. Nos últimos 20 anos, os cientistas desenvolveram repórteres fluorescentes que podem usar para ler a dinâmica de moléculas individuais dentro das células. No entanto, normalmente apenas um ou dois desses sinais podem ser observados por vez, porque um microscópio não pode distinguir entre muitas cores fluorescentes.

Os pesquisadores do MIT desenvolveram agora uma maneira de criar imagens de até cinco tipos diferentes de moléculas ao mesmo tempo, medindo cada sinal de locais distintos e aleatórios em uma célula. Essa abordagem pode permitir que os cientistas aprendam muito mais sobre as complexas redes de sinalização que controlam a maioria das funções celulares, diz Edward Boyden, o professor Y. Eva Tan em Neurotecnologia e professor de engenharia biológica, artes e ciências da mídia, cérebro e ciências cognitivas em MIT.

“Existem milhares de moléculas codificadas pelo genoma e elas estão interagindo de maneiras que não entendemos. Somente observando-os ao mesmo tempo podemos entender seus relacionamentos ”, diz Boyden, que também é membro do Instituto McGovern de Pesquisa do Cérebro do MIT e do Instituto Koch para Pesquisa Integrativa do Câncer.

Em um novo estudo, Boyden e seus colegas usaram esta técnica para identificar duas populações de neurônios que respondem aos sinais de cálcio de maneiras diferentes, o que pode influenciar como eles codificam memórias de longo prazo, dizem os pesquisadores.

Boyden é o autor sênior do estudo, que aparece hoje na Cell . Os principais autores do artigo são Changyang Linghu, pós-doutorando do MIT, e Shannon Johnson, estudante de graduação.

Aglomerados fluorescentes

Para tornar a atividade molecular visível dentro de uma célula, os cientistas normalmente criam repórteres fundindo uma proteína que detecta uma molécula alvo com uma proteína que brilha. “Isso é semelhante a como um detector de fumaça detecta a fumaça e, em seguida, acende uma luz”, diz Johnson, que também é membro do Yang-Tan Center for Molecular Therapeutics. A proteína brilhante mais comumente usada é a proteína fluorescente verde (GFP), que é baseada em uma molécula originalmente encontrada em uma água-viva fluorescente.

“Normalmente, um biólogo pode ver uma ou duas cores ao mesmo tempo em um microscópio, e muitos dos repórteres por aí são verdes, porque eles são baseados na proteína fluorescente verde”, diz Boyden. “O que faltou até agora é a capacidade de ver mais do que alguns desses sinais ao mesmo tempo.”

“Assim como ouvir o som de um único instrumento de uma orquestra está longe de ser suficiente para apreciar totalmente uma sinfonia”, diz Linghu, “ao permitir a observação de vários sinais celulares ao mesmo tempo, nossa tecnologia nos ajudará a entender a 'sinfonia 'de atividades celulares. ”

Para aumentar o número de sinais que eles podiam ver, os pesquisadores começaram a identificar os sinais por localização em vez de cor. Eles modificaram os repórteres existentes para fazer com que eles se acumulassem em grupos em diferentes locais dentro de uma célula. Eles fizeram isso adicionando dois pequenos peptídeos a cada repórter, o que ajudou os repórteres a formar grupos distintos dentro das células.

“É como ter o repórter X amarrado a um bloco de LEGO e o repórter Z amarrado a uma peça K'NEX - apenas blocos de LEGO se encaixam em outros blocos de LEGO, fazendo com que apenas o repórter X seja agrupado com mais do repórter X”, diz Johnson .

Com essa técnica, cada célula acaba com centenas de grupos de repórteres fluorescentes. Depois de medir a atividade de cada cluster sob um microscópio, com base na alteração da fluorescência, os pesquisadores podem identificar qual molécula estava sendo medida em cada cluster, preservando a célula e colorindo para marcadores de peptídeo que são exclusivos de cada repórter. Os marcadores peptídicos são invisíveis na célula viva, mas podem ser corados e vistos após a obtenção da imagem ao vivo. Isso permite aos pesquisadores distinguir os sinais de moléculas diferentes, mesmo que todas elas possam apresentar a mesma cor fluorescente na célula viva.

Usando essa abordagem, os pesquisadores mostraram que podiam ver cinco sinais moleculares diferentes em uma única célula. Para demonstrar a utilidade potencial dessa estratégia, eles mediram as atividades de três moléculas em paralelo - cálcio, AMP cíclico e proteína quinase A (PKA). Essas moléculas formam uma rede de sinalização que está envolvida em muitas funções celulares diferentes em todo o corpo. Nos neurônios, ele desempenha um papel importante na tradução de uma entrada de curto prazo (dos neurônios upstream) em mudanças de longo prazo, como o fortalecimento das conexões entre os neurônios - um processo que é necessário para aprender e formar novas memórias.

Aplicando esta técnica de imagem aos neurônios piramidais no hipocampo, os pesquisadores identificaram duas novas subpopulações com diferentes dinâmicas de sinalização de cálcio. Uma população mostrou respostas lentas ao cálcio. Na outra população, os neurônios tiveram respostas de cálcio mais rápidas. A última população teve respostas de PKA maiores. Os pesquisadores acreditam que essa resposta elevada pode ajudar a sustentar mudanças duradouras nos neurônios.

Redes de sinalização de imagem

Os pesquisadores agora planejam tentar essa abordagem em animais vivos para que possam estudar como as atividades da rede de sinalização se relacionam com o comportamento, e também expandi-lo para outros tipos de células, como as células imunológicas. Esta técnica também pode ser útil para comparar padrões de rede de sinalização entre células de tecido saudável e doente.

Neste artigo, os pesquisadores mostraram que podiam registrar cinco sinais moleculares diferentes ao mesmo tempo e, ao modificar sua estratégia existente, eles acreditam que poderiam chegar a 16. Com trabalho adicional, esse número poderia chegar às centenas, dizem eles.

“Isso realmente pode ajudar a abrir algumas dessas questões difíceis sobre como as partes de uma célula funcionam juntas”, diz Boyden. “Pode-se imaginar uma época em que podemos assistir a tudo o que acontece em uma célula viva, ou pelo menos a parte envolvida com o aprendizado, ou com a doença, ou com o tratamento de uma doença.”

A pesquisa foi financiada pela Friends of the McGovern Institute Fellowship; a bolsa J. Douglas Tan; Lisa Yang; o Centro Yang-Tan de Terapêutica Molecular; John Doerr; o Projeto de Filantropia Aberta; o Programa HHMI-Simons Faculty Scholars; o Programa Human Frontier Science; o Laboratório de Pesquisa do Exército dos EUA; o MIT Media Lab; o Fundo de Inovação do Instituto Picower; o National Institutes of Health, incluindo um NIH Director's Pioneer Award; e a National Science Foundation.

 

.
.

Leia mais a seguir