Cientistas do Instituto de Tecnologia de Ta³quio decifraram como avaliar quantitativamente os efeitos demudanças epigenanãticas especa­ficas na taxa de transcrição, desenvolvendo um modelo matema¡tico. Usando seu manãtodo, eles geraram com sucesso modificações de histonas portadoras de cromatina reconstitua­das in vitro. Seu estudo publicado na Nucleic Acids Research fornece uma abordagem quantitativa precisa para entender como as alterações especa­ficas do local nas protea­nas histonas afetam a acessibilidade da cromatina e os na­veis de expressão gaªnica.

A criação de uma única protea­na éum processo longo e complicado. Atémesmo a geração de seu projeto, conhecido como transcrição de codificação, a partir de um modelo de DNA envolve várias etapas e jogadores. Para comea§ar, o DNA égeralmente encontrado perfeitamente enrolado em protea­nas chamadas histonas para formar um nucleossomo, a subunidade fundamental de uma estrutura fortemente condensada chamada cromatina. A extensão de sua condensação determina quanto do DNA estãodispona­vel para o processo de transcrição. As alterações nessas histonas, como a acetilação, também influenciam a acessibilidade da cromatina para a expressão gaªnica. Essas modificações epigenanãticas desempenham um papel crucial na regulação da expressão gaªnica. Atéo momento, ainda hámuito a ser explorado sobre como esses efeitos epigenanãticos podem ser quantificados com precisão e como as modificações de histonas especa­ficas do local podem afetar a expressão gaªnica.

Para responder a essas perguntas, um grupo de pesquisadores liderado pelo Prof. Masahiro Takinoue do Instituto de Tecnologia de Ta³quio, Prof. Kohki Okabe da Universidade de Ta³quio e Prof. Takashi Umehara do Centro RIKEN para Pesquisa Dina¢mica de Biossistemas, Japa£o, desenvolveram um modelo cinanãtico quantificar a contribuição dasmudanças epigenanãticas nas taxas de transcrição com base em resultados experimentais altamente quantitativos. Falando sobre seu trabalho recente publicado na Nucleic Acids Research , Takinoue explica: "A contribuição de cada modificaçãoO estado de cada histona para as etapas sequenciais da transcrição da cromatina ainda não foi quantificado devido a  dificuldade na reconstituição precisa de um molde de cromatina com a (s) modificação (aµes) epigenanãtica (aµes) de interesse e quantificação da transcrição de RNA a partir dele. Usando a expansão do ca³digo genanãtico e a sa­ntese de protea­nas livres de células, sintetizamos a histona H4 contendo acetilação (aµes) especa­fica (s) do local projetada e reconstitua­mos um nucleossomo tetraacetilado. "

As modificações das histonas tem como alvo vários esta¡gios (conforme descrito na Figura 1) no processo de transcrição nonívelda cromatina, o que pode, por sua vez, afetar a taxa de transcrição. O primeiro esta¡gio, acessibilidade a  cromatina, envolve a abertura da estrutura fortemente condensada para torna¡-la acessa­vel a  ma¡quina de transcrição. O segundo esta¡gio éa formação de cromatina transcricionalmente competente, que prepara a cromatina para a ligação de complexos sintetizadores de transcritos. O terceiro esta¡gio éo priming antes da transcrição, o que auxilia na montagem de protea­nas acessãorias necessa¡rias para iniciar a transcrição. O esta¡gio final da transcrição envolve a adição sequencial de nucleota­deos para formar a transcrição.

 

Para estudar como as modificações especa­ficas da histona, incluindo a acetilação, afetam os esta¡gios da transcrição, os pesquisadores criaram um nucleossomo reconstitua­do carregando duas ca³pias de uma sequaªncia codificadora de RNA de Xenopus, uma espanãcie de sapo, com acetilação em locais específicos das protea­nas histonas . Este sistema simula asmudanças dina¢micas na cromatina dentro da canãlula viva, que afetam a transcrição. Eles desenvolveram um sistema de detecção baseado em fluorescaªncia preciso e altamentesensívelque pode medir as concentrações ma­nimas de transcritos em tempo real. Ao aplicar seu modelo cinanãtico (ver Figura 2), eles descobriram que a acetilação em quatro locais específicos da histona aumenta a acessibilidade da cromatina três vezes quando comparada com a cromatina sem acetilação.

A versatilidade do modelo também permite que seja usado para quantificar outras modificações epigenanãticas. Destacando as aplicações potenciais de seu estudo, Takinoue diz: "Nosso modelo cinanãtico descrito matematicamente nos permitiu determinar as taxas de transcrição da cromatina de modelos de cromatina não acetilada e tetra-acetilada. Nossa metodologia seráaplica¡vel a uma ampla variedade de modelos de cromatina mediada por cromatina reações para compreensão quantitativa da importa¢ncia das modificações epigenanãticas . "