Tecnologia Científica
Biofilmes funcionais de E. coli responsivos a luz como andaimes para mineralização de hidroxiapatita
Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos a luz como andaimes para mineralizaa§a£o de HA. Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos a luz como andaimes para mineralizaa§a£o de HA. (a) Ilustraz£o esquema¡tica de bio
Por
Thamarasee Jeewandara - 02/01/2021
Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos a luz como andaimes para mineralização de HA. Engenharia de biofilmes funcionais de E. coli responsivos a luz como andaimes para mineralização de HA. (a) Ilustração esquema¡tica de biofilmes de E. coli de tipo selvagem compreendendo nanofibras extracelulares de amiloide CsgA, que são os principais componentes da proteana do biofilme que contribuem para a aderaªncia robusta de biofilmes asuperfÍcies sãolidas. (b) Ilustração esquema¡tica de Mfps das placas adesivas do mexilha£o da Califórnia M. californianus. Mfp3S-pep (abaixo) éum peptadeo adesivo bioinspirado que imita a proteana Mfp3S original encontrada nas placas adesivas de M. californianus. O Mfp3S-pep éenriquecido com resíduos de a¡cido aspa¡rtico (azul), lisina (verde) e tirosina (vermelho), conhecidos por seus papanãis funcionais na promoção da nucleação, crescimento e adesão do HA. (c) Esquema mostrando os componentes genanãticos do biofilme de E. coli responsivo a luz. O projeto de biofilmes funcionais foi possibilitado pela fusão de sequaªncias que codificam a proteana CsgA e Mfp3S-pep, ambas posicionadas a jusante do elemento de controle transcricional pDawnsensívela luz. No circuito pDawn, a expressão constitutiva da histidina quinase YF1 e seu regulador de resposta cognata FixJ érigidamente regulada pelo promotor LacIq, enquanto a expressão do repressor de fago λ cI écontrolada pelo promotor FixK2. Apa³s a iluminação com luz azul, a atividade da quinase de YF1 e a expressão consequente de cI são ambas inibidas, o que por sua vez ativa o promotor λ pR para promover a expressão de CsgA-Mfp3S-pep. (d) Esquema mostrando a deposição local de minerais HA nas nanofibras extracelulares funcionais compostas por proteanas de fusão CsgA-Mfp3S-pep, secretada por E. coli responsiva a luz projetada, a cepa lightreceiver-CsgAosMfp3S-pep. (e) Imagem TEM mostrando células e matriz extracelular com fibras amila³ides abundantes nos biofilmes. Barra de escala, 500 nm. f, imagem TEM mostrando o compa³sito formado e cristais semelhantes a ripas precipitados nassuperfÍcies das nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 a— SBF. O padrãoSAED correspondente apresenta arcos de difração atribuados aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuados a fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito: Imagem TEM mostrando o compa³sito formado e os cristais semelhantes a ripas precipitados nassuperfÍcies de nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 a— SBF. O padrãoSAED correspondente apresenta arcos de difração atribuados aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuados a fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito: Imagem TEM mostrando o compa³sito formado e os cristais semelhantes a ripas precipitados nassuperfÍcies de nanofibras extracelulares após 7 d de mineralização em 1,5 a— SBF. O padrãoSAED correspondente apresenta arcos de difração atribuados aos planos (002), (211) e (004). Barra de escala, 500 nm. g, mapeamento de EDS ilustrando os elementos Ca, O e P intrinsecamente atribuados a fase HA. Barras de escala, 500 nm. Crédito:Nature Chemical Biology , doi: https: //doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z
Os organismos vivos desenvolveram mecanismos de biomineralização para construir materiais compostos estruturalmente ordenados e ambientalmente adapta¡veis. Embora as equipes de pesquisa tenham melhorado significativamente a pesquisa de mineralização biomimanãtica em laboratório, ainda édifacil projetar compósitos mineralizados com caracteristicas estruturais e componentes vivos muito parecidos com seus equivalentes nativos. Em um novo relatório agora publicado na Nature Chemical Biology , Yanyi Wang e uma equipe de pesquisa em física, materiais avana§ados, biologia sintanãtica e engenharia na China, desenvolveram compostos vivos padronizados e gradientes inspirados em materiais naturais graduados. Eles acoplaram a formação de biofilme bacteriano induzavel por luz com hidroxiapatita biomimanãtica(HA) mineralização neste trabalho, para mostrar como a localização e o grau de mineralização podem ser controlados. As células nos compostos permaneceram via¡veis ​​enquanto detectavam e respondiam aos sinais ambientais. Os compósitos mostraram um aumento de 15 vezes no ma³dulo de Young (isto anã, rigidez, a razãoentre tensão e deformação) após a mineralização. O trabalho lana§a luz para desenvolver compósitos vivos com capacidade de resposta dina¢mica e adaptabilidade ambiental.
Biomineralização em laboratório
O organismo vivo pode produzir uma variedade de estruturas compostas orga¢nico-inorga¢nicas hiera¡rquicas com base na biomineralização , onde exemplos nota¡veis ​​incluem os dentes radulares de quita´nios, escamas de peixes e mandabulas de lagostins que cumprem diversas funções biológicas. O tempo e o grau de biomineralização devem ser controlados com precisão pelas células para formar estruturas e funções precisas nos organismos vivos . Pesquisas recentes em mineralização biomimanãtica destacaram a importa¢ncia de explorar abordagens controladas por células para produzir padraµes de vida e compostos graduados como uma área promissora, mas amplamente inexplorada. As disciplinas de biologia sintanãtica e ciência dos materiaisdesencadearam uma sanãrie de circuitos genanãticos sofisticados e ecola³gicos para a bioengenharia de uma sanãrie de novas funções celulares . Neste trabalho, Wang et al. desenvolveram materiais compostos vivos e bioinspirados por meio do aproveitamento de biofilmes de Escherichia coli indutaveis por luz, juntamente com mineralização biomimanãtica. O trabalho abrira¡ portas para a integração de células modificadas para produzir materiais mineralizados com caracteristicas estruturais e vivas.
Mineralização espacialmente controla¡vel de biofilmes indutaveis por luz para compósitos
vivos padronizados. (a) Esquema¡tico da configuração experimental e etapas sequenciais para
a produção de compósitos padronizados vivos. O padrãode folha azul representado na
ilustração foi projetado em uma placa de Petri contendo a cepa lightreceiver-CsgA-Mfp3S-
pep suspensa em meio. A luz azul desencadeia a formação de biofilme funcional atravanãs
da expressão regulada por luz das proteanas CsgA-Mfp3S-pep da cepa lightreceiver-CsgA-
Mfp3S-pep. O meio de cultura na placa de Petri foi então substituado por 1,5 a— SBF, seguido
de incubação a 37 ° C para formar os compósitos. Apa³s o processo de mineralização, aTc
foi adicionado para induzir a expressão de uma proteana fluorescente vermelha (mCherry).
(b) Imagem da ca¢mera digital dos biofilmes padronizados corados com CV. Barra de escala,
1 cm. (c) Imagens de SEM mostrando a morfologia dasuperfÍcie dos biofilmes padronizados.
Barras de escala: 2 µm (esquerda), 1 µm (direita). (d) Imagem da ca¢mera digital do composto
mineralizado subsequente que manteve o padrãooriginal. Barra de escala, 1 cm. (e) Imagens
SEM mostrando as microestruturas desuperfÍcie do compa³sito mineralizado. Barras de
escala: 2 µm (esquerda), 1 µm (direita). (f, g) Ana¡lise confocal de microscopia de varredura
a laser da viabilidade bacteriana em biofilmes (f) e compósitos (g). Barras de escala, 5 µm.
Observe que o corante SYTO 9 e o PI foram aplicados como agentes de marcação para corar células vivas (verdes) e mortas (vermelhas), respectivamente. (h) Fluorescaªncia induzida do
composto vivo registrado com um sistema ChemiDoc XRS. Barra de escala, 1 cm. i, a
microscopia confocal demonstrou a expressão de mCherry das bactanãrias no composto. Barra
de escala, 20 µm. j, Imagens confocais de um composto vivo após induzir a expressão de
mCherry e rotulado com calceana, o que indicou uma distribuição homogaªnea de
componentes orga¢nicos e minerais inorga¢nicos dentro dos compostos vivos padronizados.
Barras de escala, 20 µm. Crédito:Nature Chemical Biology , doi: https:
//doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z
Seleção de ma³dulos de proteana para mineralização de hidroxiapatita (HA) e desenvolvimento de um biofilmesensívela luz
A equipe selecionou proteanas de fusão para projetar a mineralização, promovendo biofilmes de E. coli. Com base em experimentos anteriores , eles selecionaram a proteana Mefp5 - origina¡ria de Mytilus edulis , seguida de Mfp3S - origina¡ria de Mytilus californianus e outra variante do peptadeo Mfp3S (Mfsp3S-pep) para iniciar a mineralização e promover a adesão. A equipe construiu proteanas de fusão contendo um domanio principal de proteana do biofilme de E. colipara formar proteanas de fusão CsgA-Mfp e confirmou sua secreção potencial de células modificadas. Eles então selecionaram a proteana de fusão CsgA-Mfp3S-pep como representante para a mineralização da hidroxiapatita e conduziram experimentos para verificar a função da proteana para destacar seu papel durante a mineralização e a formação de cristais. Posteriormente, Wang et al. construiu uma cepa formadora de biofilme induzavel por luz denominada receptor de luz -CsgA-Mfp3S-pep que pode ser rigidamente regulada por meio de iluminação de luz azul .
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A cepasensívela luz pode gerar materiais de biofilme funcionais após iluminação com luz para promover a mineralização de hidroxiapatita (HA). Para validar isso, os cientistas expuseram a cepasensívela luz a luz azul em uma placa de Petri e usaram a coloração histola³gica e imagens de microscopia eletra´nica de transmissão (TEM) para mostrar a produção de fibras amila³ides nos biofilmes. Comparativamente, eles não observaram fibras amila³ides em amostras crescidas no escuro. A matriz extracelular projetada também atuou como um modelo para a mineralização de HA no tempo, o que eles confirmaram após 7 dias de incubação com base em técnicas de difração de raios-X (XRD) e espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS).
Formando compostos vivos controlados
Com base na naturezasensívela luz dos biofilmes projetados, Wang et al. formação de biofilme manipulado no Espaço-tempo para controlar a formação de compósitos. Eles conseguiram isso iluminando um padrãode folha em culturas de bactanãrias laquidas em placas de petri de poliestireno que recapitulavam fielmente o padrãode luz projetado sobre os biofilmes bacterianos. Apa³s 7 dias de mineralização, o composto gerado nas placas de Petri manteve o padrãooriginal, conforme observado por meio de microscopia eletra´nica de varredura. A abordagem regulada por luz controlou a forma do composto com base em projeções de padrãode grade e resolução espacial de luz em microescala - compara¡vel ao tamanho das bactanãrias vivas. A equipe então verificou a viabilidade de células vivas e intactas por meio da engenharia dos compostos vivos para expressar proteanas fluorescentes, conforme confirmado por imagens de microscopia confocal . A partir daa, eles utilizaram a análise termogravimanãtrica para quantificar os componentes inorga¢nicos dos compósitos mineralizados, onde o material inorga¢nico aumentou proporcionalmente com o tempo de imersão em fluido corporal simulado (SBF). Wang et al. também comparou o ma³dulo de Young do biofilme usando uma técnica de micro-indentação para mostrar como a mineralização fortaleceu os biofilmes de E. coli para proteger as células.
Compostos de gradiente de densidade controlada
Acoplamento de biofilmes projetados com mineralização para captura e imobilização
robustas de microesferas em substratos. (a) Esquema mostrando a captura e imobilização
de microesferas em uma lâmina de vidro em solução. Microesferas de PS suspensas em meio
de cultura foram capturadas e imobilizadas em um substrato atravanãs da formação de
biofilme seguida de mineralização em 1,5 a— fluido corporal simulado (SBF). (b) Imagens
fluorescentes mostrando os dois tipos de biofilmes (colunas esquerda e central) e
microesferas imobilizadas de compa³sito vivo (coluna direita) nos substratos antes (topo)
e após (parte inferior) do desafio com jato de águaa uma pressão de descarga constante
de 8 psi. Barras de escala, 100 µm. (c) Quantificação das capacidades relativas de diferentes
biofilmes e compósitos vivos para colar e imobilizar microesferas de PS no substrato. Os
resultados são apresentados como média ± dp Da esquerda para a direita: P = 0,00003,
P = 0,000004. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. As estatasticas são derivadas usando um
teste t bilateral. Os dados são representativos de n = 3 experimentos independentes.
Crédito: Nature Chemical Biology , doi: https: //doi.org/10.1038/s41589-020-00697-z
Abordagens de engenharia de tecidos enfatizaram a necessidade de identificar precisamente entre os tecidos duros e molespara um desempenho fisiola³gico bem-sucedido, portanto, a intensidade da luz pode ser ajustada para controlar a densidade e as propriedades meca¢nicas de materiais vivos projetados. Zhang et al. conseguiu isso expondo culturas de E. coli a diferentes intensidades de iluminação para revelar como a espessura do biofilme diminuaa com a diminuição da intensidade da luz azul. Eles também mostraram como a mineralização era fortemente e localmente dirigida pelas proteanas de fusão Mfsp3S-pep projetadas. Em seguida, eles estudaram as propriedades meca¢nicas locais de regiaµes iluminadas com micro-indentação para observar um aumento de quatro vezes no ma³dulo de Young para destacar compostos vivos projetados com gradientes minerais ajusta¡veis ​​e propriedades meca¢nicas para interfaces regenerativas de tecido para osso em aplicações de engenharia de tecido ósseo .
Implantando compostos vivos para reparo de danos específicos do local
Os cientistas também estudaram a capacidade dos biofilmes projetados para se agregar para reparar danos por colagem de microesferas de poliestireno, junto com a mineralização de HA. Como prova de conceito, eles aplicaram compostos mineralizados vivos para preencher e reparar rachaduras projetadas nasuperfÍcie de uma placa de Petri de poliestireno. Durante os experimentos, os biofilmes adesivos induzidos por luz capturaram microesferas em solução para preencher o sulco danificado propositalmente criado, enquanto nanofibras em biofilmes agiram como um modelo para a mineralização de hidroxiapatita para consolidar a cimentação induzida por luz sob iluminação de luz azul. Usando microscopia eletra´nica de varredura, Wang et al. mostrou como as bactanãrias e a matriz extracelular circundante aderiram junto com microesferas para ilustrar a função adesiva dos biofilmes vivos. Os compósitos mineralizados HA formaram camadas densas semelhantes a concreto que preencheram o sulco danificado para destacar a funcionalidade de mineralização dos compósitos vivos para maior durabilidade e aplicações de reparo.
Outlook
Desta forma, Yanyi Wang e seus colegas produziram compósitos vivos com padrãobioinspirado e compostos vivos classificados com uma plataforma de biofilme regulada por luz. Os compostos resultantes exibiram capacidade de resposta ambiental semelhante a suas contrapartes nativas. As células dentro dos compósitos permaneceram via¡veis ​​e responderam aos estamulos ambientais mesmo após a mineralização. O trabalho abre um caminho para criar compostos orga¢nicos-inorga¢nicos vivos e funcionais com recursos adaptativos e de autorreparação com aplicações em biomedicina, medicina regenerativa e biorremediação .
