Tecnologia Científica

Pesquisadores desenvolvem um 'mini' sistema de edição de genoma CRISPR
Em um artigo publicado em 3 de setembro na Molecular Cell , Qi e seus colaboradores anunciam o que acreditam ser um grande passo para o CRISPR: um sistema mini CRISPR eficiente e multifuncional.
Por Molecular Cell - 04/09/2021


Proteína Cas9 associada a CRISPR (branco) de Staphylococcus aureus com base em Protein Database ID 5AXW. Crédito: Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)

A analogia comum para a edição do gene CRISPR é que ele funciona como uma tesoura molecular, cortando seções selecionadas do DNA. Stanley Qi, professor assistente de bioengenharia da Universidade de Stanford, gosta dessa analogia, mas acha que é hora de reimaginar o CRISPR como um canivete suíço.

"O CRISPR pode ser tão simples como um cortador ou mais avançado como um regulador, um editor, um rotulador ou gerador de imagens. Muitas aplicações estão surgindo deste campo empolgante", disse Qi, que também é professor assistente de química e biologia de sistemas em a Stanford School of Medicine e um bolsista do Stanford ChEM-H Institute.

Os muitos sistemas CRISPR diferentes em uso ou sendo clinicamente testados para terapia genética de doenças no olho, fígado e cérebro, no entanto, permanecem limitados em seu escopo porque todos sofrem da mesma falha: eles são muito grandes e, portanto, muito difícil de entregar nas células , tecidos ou organismos vivos.

Em um artigo publicado em 3 de setembro na Molecular Cell , Qi e seus colaboradores anunciam o que acreditam ser um grande passo para o CRISPR: um sistema mini CRISPR eficiente e multifuncional. Enquanto os sistemas CRISPR comumente usados ​​- com nomes como Cas9 e Cas12a denotando várias versões de proteínas associadas a CRISPR (Cas) - são feitos de cerca de 1000 a 1500 aminoácidos, seu "CasMINI" tem 529.

Os pesquisadores confirmaram em experimentos que o CasMINI poderia excluir, ativar e editar o código genético, assim como seus homólogos mais robustos. Seu tamanho menor significa que deve ser mais fácil de administrar às células humanas e ao corpo humano, tornando-o uma ferramenta potencial para o tratamento de diversas doenças, incluindo doenças oculares, degeneração de órgãos e doenças genéticas em geral.

Esforço persistente

Para tornar o sistema o menor possível, os pesquisadores decidiram começar com a proteína CRISPR Cas12f (também conhecida como Cas14), porque ela contém apenas cerca de 400 a 700 aminoácidos. No entanto, como outras proteínas CRISPR, Cas12f origina-se naturalmente de Archaea - organismos unicelulares - o que significa que não é adequado para células de mamíferos, muito menos células ou corpos humanos. Apenas algumas proteínas CRISPR são conhecidas por trabalhar em células de mamíferos sem modificação. Infelizmente, CAS12f não é um deles. Isso o torna um desafio atraente para bioengenheiros como Qi.
 
"Nós pensamos, 'Ok, milhões de anos de evolução não foram capazes de transformar este sistema CRISPR em algo que funcione no corpo humano . Podemos mudar isso em apenas um ou dois anos?'", Disse Qi. "Pelo que sei, pela primeira vez, transformamos um CRISPR que não funciona em um que funciona."

Na verdade, Xiaoshu Xu, um estudioso de pós-doutorado no laboratório de Qi e principal autor do artigo, não viu atividade do Cas12f natural em células humanas. Xu e Qi levantaram a hipótese de que o problema era que o DNA do genoma humano é mais complicado e menos acessível do que o DNA microbiano, tornando difícil para o Cas12f encontrar seu alvo nas células. Ao olhar para a estrutura prevista computacionalmente do sistema Cas12f, ela escolheu cuidadosamente cerca de 40 mutações na proteína que poderiam potencialmente contornar esta limitação e estabeleceu um pipeline para testar muitas variantes da proteína ao mesmo tempo. Uma variante de trabalho iria, em teoria, tornar uma célula humana verde ao ativar a proteína fluorescente verde (GFP) em seu genoma.

"No início, esse sistema não funcionou por um ano", disse Xu. "Mas depois de iterações de bioengenharia, vimos algumas proteínas de engenharia começarem a ser ativadas, como mágica. Isso nos fez realmente apreciar o poder da biologia sintética e da bioengenharia."

Os primeiros resultados bem-sucedidos foram modestos, mas entusiasmaram Xu e a encorajaram a seguir em frente porque isso significava que o sistema funcionava. Em muitas iterações adicionais, ela foi capaz de melhorar ainda mais o desempenho da proteína. "Começamos vendo apenas duas células mostrando um sinal verde e agora, após a engenharia, quase todas as células são verdes sob o microscópio", disse Xu.

"Em algum momento, tive que impedi-la", lembrou Qi. "Eu disse 'Isso é bom por agora. Você fez um sistema muito bom. Devíamos pensar em como essa molécula pode ser usada para aplicações.'"

Além da engenharia de proteínas, os pesquisadores também criaram o RNA que guia a proteína Cas para seu DNA-alvo. As modificações em ambos os componentes foram cruciais para fazer o sistema CasMINI funcionar em células humanas. Eles testaram a capacidade do CasMINI de deletar e editar genes em células humanas baseadas em laboratório, incluindo genes relacionados à infecção por HIV, resposta imune antitumoral e anemia. Funcionou em quase todos os genes testados, com respostas robustas em vários deles.

Abrindo a porta

Os pesquisadores já começaram a reunir colaborações com outros cientistas para buscar terapias genéticas. Eles também estão interessados ​​em como podem contribuir para os avanços nas tecnologias de RNA - como o que foi usado para desenvolver as vacinas de mRNA COVID-19 - onde o tamanho também pode ser um fator limitante.

"Essa capacidade de projetar esses sistemas é desejada em campo desde os primeiros dias do CRISPR e sinto que fizemos nossa parte para avançar em direção a essa realidade", disse Qi. "E essa abordagem de engenharia pode ser amplamente útil. Isso é o que me entusiasma - abrindo a porta para novas possibilidades."

 

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