Tecnologia Científica

Pesquisadores desenvolvem um 'mini' sistema de edição de genoma CRISPR
Em um artigo publicado em 3 de setembro na Molecular Cell , Qi e seus colaboradores anunciam o que acreditam ser um grande passo para o CRISPR: um sistema mini CRISPR eficiente e multifuncional.
Por Molecular Cell - 04/09/2021


Protea­na Cas9 associada a CRISPR (branco) de Staphylococcus aureus com base em Protein Database ID 5AXW. Crédito: Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)

A analogia comum para a edição do gene CRISPR éque ele funciona como uma tesoura molecular, cortando seções selecionadas do DNA. Stanley Qi, professor assistente de bioengenharia da Universidade de Stanford, gosta dessa analogia, mas acha que éhora de reimaginar o CRISPR como um canivete suiço.

"O CRISPR pode ser tão simples como um cortador ou mais avana§ado como um regulador, um editor, um rotulador ou gerador de imagens. Muitas aplicações estãosurgindo deste campo empolgante", disse Qi, que também éprofessor assistente de química e biologia de sistemas em a Stanford School of Medicine e um bolsista do Stanford ChEM-H Institute.

Os muitos sistemas CRISPR diferentes em uso ou sendo clinicamente testados para terapia genanãtica de doenças no olho, fígado e cérebro, no entanto, permanecem limitados em seu escopo porque todos sofrem da mesma falha: eles são muito grandes e, portanto, muito difa­cil de entregar nas células , tecidos ou organismos vivos.

Em um artigo publicado em 3 de setembro na Molecular Cell , Qi e seus colaboradores anunciam o que acreditam ser um grande passo para o CRISPR: um sistema mini CRISPR eficiente e multifuncional. Enquanto os sistemas CRISPR comumente usados ​​- com nomes como Cas9 e Cas12a denotando várias versaµes de protea­nas associadas a CRISPR (Cas) - são feitos de cerca de 1000 a 1500 aminoa¡cidos, seu "CasMINI" tem 529.

Os pesquisadores confirmaram em experimentos que o CasMINI poderia excluir, ativar e editar o ca³digo genanãtico, assim como seus homa³logos mais robustos. Seu tamanho menor significa que deve ser mais fa¡cil de administrar a s células humanas e ao corpo humano, tornando-o uma ferramenta potencial para o tratamento de diversas doena§as, incluindo doenças oculares, degeneração de órgãos e doenças genanãticas em geral.

Esfora§o persistente

Para tornar o sistema o menor possí­vel, os pesquisadores decidiram comea§ar com a protea­na CRISPR Cas12f (também conhecida como Cas14), porque ela contanãm apenas cerca de 400 a 700 aminoa¡cidos. No entanto, como outras protea­nas CRISPR, Cas12f origina-se naturalmente de Archaea - organismos unicelulares - o que significa que não éadequado para células de mama­feros, muito menos células ou corpos humanos. Apenas algumas protea­nas CRISPR são conhecidas por trabalhar em células de mama­feros sem modificação. Infelizmente, CAS12f não éum deles. Isso o torna um desafio atraente para bioengenheiros como Qi.
 
"Na³s pensamos, 'Ok, milhões de anos de evolução não foram capazes de transformar este sistema CRISPR em algo que funcione no corpo humano . Podemos mudar isso em apenas um ou dois anos?'", Disse Qi. "Pelo que sei, pela primeira vez, transformamos um CRISPR que não funciona em um que funciona."

Na verdade, Xiaoshu Xu, um estudioso de pa³s-doutorado no laboratório de Qi e principal autor do artigo, não viu atividade do Cas12f natural em células humanas. Xu e Qi levantaram a hipa³tese de que o problema era que o DNA do genoma humano émais complicado e menos acessa­vel do que o DNA microbiano, tornando difa­cil para o Cas12f encontrar seu alvo nas células. Ao olhar para a estrutura prevista computacionalmente do sistema Cas12f, ela escolheu cuidadosamente cerca de 40 mutações na protea­na que poderiam potencialmente contornar esta limitação e estabeleceu um pipeline para testar muitas variantes da protea­na ao mesmo tempo. Uma variante de trabalho iria, em teoria, tornar uma canãlula humana verde ao ativar a protea­na fluorescente verde (GFP) em seu genoma.

"No ina­cio, esse sistema não funcionou por um ano", disse Xu. "Mas depois de iterações de bioengenharia, vimos algumas protea­nas de engenharia comea§arem a ser ativadas, como ma¡gica. Isso nos fez realmente apreciar o poder da biologia sintanãtica e da bioengenharia."

Os primeiros resultados bem-sucedidos foram modestos, mas entusiasmaram Xu e a encorajaram a seguir em frente porque isso significava que o sistema funcionava. Em muitas iterações adicionais, ela foi capaz de melhorar ainda mais o desempenho da protea­na. "Comea§amos vendo apenas duas células mostrando um sinal verde e agora, após a engenharia, quase todas as células são verdes sob o microsca³pio", disse Xu.

"Em algum momento, tive que impedi-la", lembrou Qi. "Eu disse 'Isso ébom por agora. Vocaª fez um sistema muito bom. Deva­amos pensar em como essa molanãcula pode ser usada para aplicações.'"

Além da engenharia de protea­nas, os pesquisadores também criaram o RNA que guia a protea­na Cas para seu DNA-alvo. As modificações em ambos os componentes foram cruciais para fazer o sistema CasMINI funcionar em células humanas. Eles testaram a capacidade do CasMINI de deletar e editar genes em células humanas baseadas em laboratório, incluindo genes relacionados a  infecção por HIV, resposta imune antitumoral e anemia. Funcionou em quase todos os genes testados, com respostas robustas em vários deles.

Abrindo a porta

Os pesquisadores já começam a reunir colaborações com outros cientistas para buscar terapias genanãticas. Eles também estãointeressados ​​em como podem contribuir para os avanços nas tecnologias de RNA - como o que foi usado para desenvolver as vacinas de mRNA COVID-19 - onde o tamanho também pode ser um fator limitante.

"Essa capacidade de projetar esses sistemas édesejada em campo desde os primeiros dias do CRISPR e sinto que fizemos nossa parte para avana§ar em direção a essa realidade", disse Qi. "E essa abordagem de engenharia pode ser amplamente útil. Isso éo que me entusiasma - abrindo a porta para novas possibilidades."

 

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