A microscopia de força atômica (AFM) oferece um manãtodo de imagem sem ra³tulo da dina¢mica biomolecular em nanoescala para resolver questões biológicas que não podem ser tratadas por meio de outros manãtodos de bioimagem, incluindo fluorescaªncia e microscopia eletra´nica de varredura. Uma vez que tais manãtodos de imagem são são possa­veis para sistemas biola³gicos extraa­dos de células ou reconstrua­dos em substratos sãolidos, a nanodina¢mica dentro de células vivas permanece amplamente inacessa­vel com os manãtodos de bioimagem existentes. Em um novo relatório agora publicado na Science Advances, Marcos Penedo e uma equipe de pesquisa em Ciência Nanolife e biotecnologia da Universidade Kanazawa, no Japa£o, superaram os limites da bioimagem usando a nanoendoscopia-AFM. Durante o processo, eles inseriram uma sonda em forma de agulha em uma canãlula viva para apresentar a fibra de actina, mapas tridimensionais (3D) e nanodina¢mica 2D do arcabouço interno da membrana commudanças indetecta¡veis ​​na viabilidade celular. Ao contra¡rio dos manãtodos AFM anteriores, a nanossonda acessou diretamente os componentes intracelulares alvo e explorou as capacidades do AFM, incluindo imagens de alta resolução, mapeamento nanomeca¢nico e reconhecimento molecular para expandir a gama observa¡vel de estruturas intracelulares em células vivas.

A dina¢mica em escala molecular dos componentes intracelulares fornece uma visão dos mecanismos fundamentais das funções celulares e das doena§as. No entanto, os manãtodos de imagem direta para tal nanodina¢mica em células vivas são desafiadores. Por exemplo, embora a microscopia eletra´nica seja útil para obter imagens de nanoestruturas de células congeladas no va¡cuo, elas são incapazes de obter imagens da nanodina¢mica em células vivas em ambientes fisiola³gicos, exceto como instanta¢neos esta¡ticos de conformações fixas. Da mesma forma, enquanto a microscopia de fluorescaªncia via rotulagem de fluorescaªncia fornece um manãtodo poderoso para visualizar a dina¢mica de protea­nas e organelas em células vivas, elas são limitadas por uma incapacidade de gerar imagens com eficiência em nanoescala. Portanto, existem fortes demandas por um manãtodo de imagem intracelular sem ra³tulo em ambientes la­quidos. A microscopia de força atômica (AFM) éum candidato potencial para o papel com a capacidade de imagem em escala sub-nanomanãtrica para visualizar a nanodina¢mica de lipa­dios, protea­nas e DNAs sem ra³tulos. No entanto, essas imagens não são representativas de sistemas biola³gicos como resultado da extração de uma canãlula ou reconstrução em um substrato sãolido in vitro. Neste trabalho, portanto, Penedo et al. propa´s um manãtodo de imagem baseado em AFM conhecido como nanoendoscopia-AFM para observar a nanodina¢mica dentro das células vivas sem rotula¡-las ou separa¡-las.

Durante os experimentos, assim como uma ca¢mera endosca³pica, os pesquisadores inseriram uma longa nanossonda parecida com uma agulhadentro de uma canãlula viva para realizar imagens AFM 2D e 3D. A equipe mostrou como a nanoendoscopia-AFM forneceu uma vantagem única para imagens de células vivas intracelulares sem ra³tulos em nanoescala. O manãtodo fornece um caminho poderoso para observar fena´menos atéentão inexplorados em sistemas biola³gicos. Penedo et al. repetidamente introduziu a nanossonda dentro da canãlula em diferentes posições da área desejada por meio de medições da curva de força versus distância. Para obter a imagem de toda a canãlula, a nanossonda precisava ser longa o suficiente para penetrar completamente na canãlula atéatingir o substrato, e com dia¢metros abaixo de 200 nm para minimizar o dano celular, facilitando a penetração da membrana. A equipe usou uma ponta tetraanãdrica de sila­cio comercial como uma nanossonda, que usaram moagem de feixe de a­ons focalizadoa sDimensões preferidas. Em seguida, a equipe usou as nanossondas dentro de diferentes áreas de uma canãlula HeLa . Eles adquiriram uma imagem de nanoendoscopia-AFM 3D de uma canãlula inteira durante os experimentos e identificaram o núcleo da canãlula HeLa do resto da canãlula. Outras medições também indicaram as estruturas granulares internas. Para minimizar o dano celular durante a penetração, Penedo et al. reduziu a força de penetração e o comprimento de indentação tanto quanto possí­vel . Eles também conduziram experimentos de viabilidade celular para confirmar que a nanoendoscopia 3D-AFM não levou a danos celulares graves ao usar nanossondas com dia¢metros abaixo de 200 nm. Usando a nanoendoscopia-AFM 3D, eles facilitaram a geração de imagens do citoesqueleto internoem células vivas para observar a organização 3D das fibras sem suporte. A equipe também fundiu com sucesso imagens intracelulares resultantes de nanoendoscopia-AFM 3D e microscopia confocal.

Desta forma, Marcos Penedo e colegas mostraram as aplicações da nanoendoscopia-AFM para medir assuperfÍcies citoplasma¡ticas internas das membranas celulares e andaimes associados para entender o arranjo 3D dos filamentos de actina em seu ambiente intracelular natural em células vivas. A equipe procurou minimizar o dano celular usando nanossondas ultrafinas em forma de agulha nos experimentos. Os manãtodos de AFM propostos produziram mapas 3D de estruturas celulares internas, além de projeções 2D combinadas com manãtodos de fluorescaªncia existentes, como microscopia confocal ou de super-resolução. O manãtodo vai lana§ar luz sobre a maquinaria celular em ação, in vivo, enquanto expaµe motores moleculares fisiola³gicos. O manãtodo também abrira¡ novas possibilidades para estudar a nanomeca¢nica intracelular que desempenha um papel importante nas funções celulares.