Tecnologia Científica

Visualizando nanoestruturas intracelulares de células vivas usando nanoendoscopia-AFM
A microscopia de força atômica (AFM) oferece um método de imagem sem rótulo de dinâmica biomolecular em nanoescala para resolver questões biológicas que não podem ser tratadas ...
Por Thamarasee Jeewandara - 08/01/2022


Técnica de nanoendoscopia-AFM 3D. (A) Esquema do método 3D nanoendoscopia-AFM, onde a nanossonda é repetidamente introduzida dentro da célula em diferentes posições na área desejada. (B) Nanossonda fabricada por FIB usada nas medições de nanoendoscopia-AFM 3D. (C e D) Curvas Fz típicas obtidas penetrando uma célula, onde uma diminuição abrupta da deflexão do cantilever é representada como um pico quando a nanossonda penetra na membrana celular externa (C), aparecendo como outro pico no caso de a nanossonda perfurar a membrana nuclear (D). (G) Mapa de células de nanoendoscopia-AFM 3D de todo o volume da célula HeLa (40 × 40 × 6 μm3) encerrado no quadrado vermelho em (E), onde a membrana celular, o núcleo e as regiões citoplasmáticas podem ser distinguidas na seção transversal exibido em (H). (I) Imagem de nanoendoscopia-AFM 3D de um volume de célula HeLa (10 × 10 × 6 μm3) delimitado por um quadrado vermelho em (F), onde as estruturas granulares internas podem ser claramente reconhecidas. Crédito: Science Advances , 10.1126 / sciadv.abj4990

A microscopia de força atômica (AFM) oferece um método de imagem sem rótulo da dinâmica biomolecular em nanoescala para resolver questões biológicas que não podem ser tratadas por meio de outros métodos de bioimagem, incluindo fluorescência e microscopia eletrônica de varredura. Uma vez que tais métodos de imagem só são possíveis para sistemas biológicos extraídos de células ou reconstruídos em substratos sólidos, a nanodinâmica dentro de células vivas permanece amplamente inacessível com os métodos de bioimagem existentes. Em um novo relatório agora publicado na Science Advances, Marcos Penedo e uma equipe de pesquisa em Ciência Nanolife e biotecnologia da Universidade Kanazawa, no Japão, superaram os limites da bioimagem usando a nanoendoscopia-AFM. Durante o processo, eles inseriram uma sonda em forma de agulha em uma célula viva para apresentar a fibra de actina, mapas tridimensionais (3D) e nanodinâmica 2D do arcabouço interno da membrana com mudanças indetectáveis ​​na viabilidade celular. Ao contrário dos métodos AFM anteriores, a nanossonda acessou diretamente os componentes intracelulares alvo e explorou as capacidades do AFM, incluindo imagens de alta resolução, mapeamento nanomecânico e reconhecimento molecular para expandir a gama observável de estruturas intracelulares em células vivas.

Dinâmica intracelular de bioimagem

A dinâmica em escala molecular dos componentes intracelulares fornece uma visão dos mecanismos fundamentais das funções celulares e das doenças. No entanto, os métodos de imagem direta para tal nanodinâmica em células vivas são desafiadores. Por exemplo, embora a microscopia eletrônica seja útil para obter imagens de nanoestruturas de células congeladas no vácuo, elas são incapazes de obter imagens da nanodinâmica em células vivas em ambientes fisiológicos, exceto como instantâneos estáticos de conformações fixas. Da mesma forma, enquanto a microscopia de fluorescência via rotulagem de fluorescência fornece um método poderoso para visualizar a dinâmica de proteínas e organelas em células vivas, elas são limitadas por uma incapacidade de gerar imagens com eficiência em nanoescala. Portanto, existem fortes demandas por um método de imagem intracelular sem rótulo em ambientes líquidos. A microscopia de força atômica (AFM) é um candidato potencial para o papel com a capacidade de imagem em escala sub-nanométrica para visualizar a nanodinâmica de lipídios, proteínas e DNAs sem rótulos. No entanto, essas imagens não são representativas de sistemas biológicos como resultado da extração de uma célula ou reconstrução em um substrato sólido in vitro. Neste trabalho, portanto, Penedo et al. propôs um método de imagem baseado em AFM conhecido como nanoendoscopia-AFM para observar a nanodinâmica dentro das células vivas sem rotulá-las ou separá-las.

Viabilidade celular de medições de nanoendoscopia-AFM 3D. (A) Diferentes áreas medidas
realizadas em uma cultura de células HeLa para o teste de viabilidade celular, incluindo
núcleos e regiões periféricas celulares: (1) 2 × 2 × 7 μm3, (2) 2 × 2 × 10 μm3, (3) 40 × 40 × 8
μm3 e (4) 2 × 2 × 7 μm3, destacados em quadrados vermelhos; duas células foram usadas
como controle, C1 e C2. (B) Taxas de viabilidade celular ao longo do tempo para as quatro
células de imagem (1 a 4) e para as duas células usadas como controle (C1 e C2), exibindo
que todas as células (imagens e controle) tinham uma intensidade de viabilidade de célula
plana semelhante razão e confirmando que as células não foram muito danificadas. (C)
Exemplo de uma imagem de fluorescência após 210 min correspondendo a (i) em (B), onde
a cor verde forte significa uma atividade esterase normal esperada para uma célula viva.
Para verificar a validade do ensaio, H2O2 foi adicionado após 260 min ao meio para matar
as células, resultando em uma diminuição das razões de viabilidade celular de todas as
células, uma indicação clara de que as células estavam morrendo. (D) Instantâneo de
fluorescência correspondente ao tempo (ii) em (B), onde os sinais de dano são claramente
visíveis em todas as células, a maioria das quais já sofreu encolhimento ou apoptose.
Crédito:Science Advances , 10.1126 / sciadv.abj4990

Experimentos de nanoendoscopia-AFM

Durante os experimentos, assim como uma câmera endoscópica, os pesquisadores inseriram uma longa nanossonda parecida com uma agulhadentro de uma célula viva para realizar imagens AFM 2D e 3D. A equipe mostrou como a nanoendoscopia-AFM forneceu uma vantagem única para imagens de células vivas intracelulares sem rótulos em nanoescala. O método fornece um caminho poderoso para observar fenômenos até então inexplorados em sistemas biológicos. Penedo et al. repetidamente introduziu a nanossonda dentro da célula em diferentes posições da área desejada por meio de medições da curva de força versus distância. Para obter a imagem de toda a célula, a nanossonda precisava ser longa o suficiente para penetrar completamente na célula até atingir o substrato, e com diâmetros abaixo de 200 nm para minimizar o dano celular, facilitando a penetração da membrana. A equipe usou uma ponta tetraédrica de silício comercial como uma nanossonda, que usaram moagem de feixe de íons focalizadoàs dimensões preferidas. Em seguida, a equipe usou as nanossondas dentro de diferentes áreas de uma célula HeLa . Eles adquiriram uma imagem de nanoendoscopia-AFM 3D de uma célula inteira durante os experimentos e identificaram o núcleo da célula HeLa do resto da célula. Outras medições também indicaram as estruturas granulares internas. Para minimizar o dano celular durante a penetração, Penedo et al. reduziu a força de penetração e o comprimento de indentação tanto quanto possível . Eles também conduziram experimentos de viabilidade celular para confirmar que a nanoendoscopia 3D-AFM não levou a danos celulares graves ao usar nanossondas com diâmetros abaixo de 200 nm. Usando a nanoendoscopia-AFM 3D, eles facilitaram a geração de imagens do citoesqueleto internoem células vivas para observar a organização 3D das fibras sem suporte. A equipe também fundiu com sucesso imagens intracelulares resultantes de nanoendoscopia-AFM 3D e microscopia confocal.

Combinação de imagem confocal e nanoendoscopia 3D-AFM. (A) Imagem de fluorescência
confocal onde os filamentos de actina corados são visíveis. (B) A imagem ampliada obtida
na área indicada pelo quadrado vermelho em (A). (C e D) Mapas 3D de nanoendoscopia-
AFM de fibras de actina do citoesqueleto obtidas na área destacada pelo quadrado vermelho
em (B), onde as posições verticais Z dos diferentes filamentos de actina (setas vermelhas) e
as membranas celulares superior e inferior são resolvidos simultaneamente. A imagem
semitransparente mostrada no quadrado vermelho em (B) corresponde à projeção 2D
dos mapas 3D mostrados em (C) e (D). Crédito: Science
Advances , 10.1126 / sciadv.abj4990

Nanoendoscopia 2D-AFM

A capacidade de inserir uma longa nanossonda em uma célula muitas vezes, mantendo a viabilidade celular, implicava no potencial de localizar o ápice da sonda dentro de uma célula viva.para realizar medições locais 2D / 3D AFM sem danos substanciais. A nanossonda pode ser inserida dentro da célula para medir o lado citoplasmático da membrana celular através do modo de modulação de amplitude AFM. As nanossondas precisavam ser longas o suficiente para penetrar completamente na célula e chegar ao fundo, ao mesmo tempo que eram finas o suficiente para reduzir o dano celular. Para conseguir isso na prática, Penedo et al. desenvolveram nanossondas feitas de carbono amorfo usando deposição de feixe de elétrons e mediram a dependência da amplitude com a distância, para determinar a integridade da célula. Eles realizaram experimentos de nanoendoscopia-AFM 2D usando uma célula de fibroblasto para ilustrar a estrutura reticular da membrana celular interna e observaram a arquitetura da célula para estudar a dinâmica interna das estruturas celulares.

Panorama

Desta forma, Marcos Penedo e colegas mostraram as aplicações da nanoendoscopia-AFM para medir as superfícies citoplasmáticas internas das membranas celulares e andaimes associados para entender o arranjo 3D dos filamentos de actina em seu ambiente intracelular natural em células vivas. A equipe procurou minimizar o dano celular usando nanossondas ultrafinas em forma de agulha nos experimentos. Os métodos de AFM propostos produziram mapas 3D de estruturas celulares internas, além de projeções 2D combinadas com métodos de fluorescência existentes, como microscopia confocal ou de super-resolução. O método vai lançar luz sobre a maquinaria celular em ação, in vivo, enquanto expõe motores moleculares fisiológicos. O método também abrirá novas possibilidades para estudar a nanomecânica intracelular que desempenha um papel importante nas funções celulares.

 

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