O Projeto Genoma Humano foi uma iniciativa ambiciosa para sequenciar cada pedaço do DNA humano. O projeto reuniu colaboradores de instituições de pesquisa de todo o mundo, incluindo o Instituto Whitehead de Pesquisa Biomédica do MIT, e foi finalmente conclua­do em 2003. Agora, mais de duas décadas depois, o professor do MIT Jonathan Weissman e seus colegas foram além da sequaªncia para apresentar o primeiro mapa funcional de genes que são expressos em células humanas. Os dados deste projeto, publicados on-line em 9 de junho na Cell , vinculam cada gene ao seu trabalho na canãlula e são o culminar de anos de colaboração no manãtodo de sequenciamento de canãlula única Perturb-seq.

Os dados estãodisponí­veis para outros cientistas usarem . “a‰ um grande recurso da mesma forma que o genoma humano éum grande recurso, pois vocêpode entrar e fazer pesquisas baseadas em descobertas”, diz Weissman, que também émembro do Instituto Whitehead e pesquisador do Howard Hughes Medical Instituto. “Em vez de definir com antecedaªncia qual biologia vocêvai observar, vocêtem esse mapa das relações gena³tipo-fena³tipo e pode acessar e examinar o banco de dados sem ter que fazer nenhum experimento.”

A tela permitiu que os pesquisadores se aprofundassem em diversas questões biológicas. Eles o usaram para explorar os efeitos celulares de genes com funções desconhecidas, investigar a resposta das mitoca´ndrias ao estresse e rastrear genes que causam perda ou ganho de cromossomos, um fena³tipo que se mostrou difa­cil de estudar no passado. “Acho que esse conjunto de dados permitira¡ todos os tipos de análises que ainda nem pensamos por pessoas que vão de outras partes da biologia e, de repente, elas tem isso dispona­vel para usar”, diz o ex-pa³s-doutorado do Weissman Lab, Tom Norman, coautor saªnior do artigo.

O projeto aproveita a abordagem Perturb-seq que permite acompanhar o impacto de ativar ou desativar genes com profundidade sem precedentes. Este manãtodo foi publicado pela primeira vez em 2016 por um grupo de pesquisadores, incluindo Weissman e o colega professor do MIT Aviv Regev, mas são poderia ser usado em pequenos conjuntos de genes e com grandes custos.

O enorme mapa Perturb-seq foi possí­vel graças ao trabalho fundamental de Joseph Replogle, um estudante de MD-PhD no laboratório de Weissman e coprimeiro autor do presente artigo. Replogle, em colaboração com Norman, que agora lidera um laboratório no Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Britt Adamson, professor assistente do Departamento de Biologia Molecular da Universidade de Princeton; e um grupo da 10x Genomics, partiu para criar uma nova versão do Perturb-seq que poderia ser ampliada. Os pesquisadores publicaram um artigo de prova de conceito na Nature Biotechnology em 2020. 

O manãtodo Perturb-seq usa a edição do genoma CRISPR-Cas9 para introduzir alterações genanãticas nas células e, em seguida, usa o sequenciamento de RNA de canãlula única para capturar informações sobre os RNAs expressos resultantes de uma determinada alteração genanãtica. Como os RNAs controlam todos os aspectos de como as células se comportam, esse manãtodo pode ajudar a decodificar os muitos efeitos celulares das alterações genanãticas.

Desde seu artigo inicial de prova de conceito, Weissman, Regev e outros usaram esse manãtodo de sequenciamento em escalas menores. Por exemplo, os pesquisadores usaram Perturb-seq em 2021 para explorar como os genes humanos e virais interagem ao longo de uma infecção com HCMV, um herpesva­rus comum.

No novo estudo, Replogle e colaboradores, incluindo Reuben Saunders, estudante de pós-graduação no laboratório de Weissman e coautor do artigo, ampliaram o manãtodo para todo o genoma. Usando linhas de células cancerosas do sangue humano, bem como células não cancerosas derivadas da retina, ele executou Perturb-seq em mais de 2,5 milhões de células e usou os dados para construir um mapa abrangente ligando gena³tipos a fena³tipos.

Ao completar a tela, os pesquisadores decidiram usar seu novo conjunto de dados e examinar algumas questões biológicas. “A vantagem do Perturb-seq éque ele permite que vocêobtenha um grande conjunto de dados de maneira imparcial”, diz Tom Norman. “Ninguanãm sabe inteiramente quais são os limites do que vocêpode obter desse tipo de conjunto de dados. Agora, a questãoanã: o que vocêrealmente faz com isso?”

A primeira e mais a³bvia aplicação foi pesquisar genes com funções desconhecidas. Como a tela também laª os fena³tipos de muitos genes conhecidos, os pesquisadores podem usar os dados para comparar genes desconhecidos com os conhecidos e procurar resultados transcricionais semelhantes, o que poderia sugerir que os produtos dos genes trabalharam juntos como parte de um complexo maior.

A mutação de um gene chamado C7orf26 em particular se destacou. Os pesquisadores notaram que os genes cuja remoção levou a um fena³tipo semelhante faziam parte de um complexo de protea­nas chamado Integrator que desempenhava um papel na criação de pequenos RNAs nucleares. O complexo Integrator écomposto de muitas subunidades menores osestudos anteriores sugeriram 14 protea­nas individuais ose os pesquisadores conseguiram confirmar que C7orf26 compunha um 15º componente do complexo.

Eles também descobriram que as 15 subunidades trabalhavam juntas em ma³dulos menores para realizar funções especa­ficas dentro do complexo do Integrador. “Sem essa visão de mil panãs de altura da situação, não estava tão claro que esses diferentes ma³dulos eram tão funcionalmente distintos”, diz Saunders.

Outra vantagem do Perturb-seq éque, como o ensaio se concentra em células únicas, os pesquisadores podem usar os dados para analisar fena³tipos mais complexos que se tornam confusos quando são estudados em conjunto com dados de outras células. “Muitas vezes, pegamos todas as células onde o 'gene X' éderrubado e fazemos a média delas para ver como elas mudaram”, diz Weissman. “Mas a s vezes, quando vocêderruba um gene, células diferentes que estãoperdendo o mesmo gene se comportam de maneira diferente, e esse comportamento pode ser perdido pela média”.

Os pesquisadores descobriram que um subconjunto de genes cuja remoção levou a resultados diferentes de canãlula para canãlula era responsável pela segregação cromossa´mica. Sua remoção estava fazendo com que as células perdessem um cromossomo ou pegassem um extra, uma condição conhecida como aneuploidia. “Vocaª não poderia prever qual era a resposta transcricional a  perda desse gene porque dependia do efeito secunda¡rio de qual cromossomo vocêganhou ou perdeu”, diz Weissman. “Percebemos que podera­amos reverter isso e criar esse fena³tipo composto procurando por assinaturas de cromossomos sendo ganhos e perdidos. Dessa forma, fizemos a primeira triagem de todo o genoma para os fatores necessa¡rios para a segregação correta do DNA”.

“Acho que o estudo de aneuploidia éa aplicação mais interessante desses dados atéagora”, diz Norman. “Ele captura um fena³tipo que vocêsão pode obter usando uma leitura de canãlula única. Vocaª não pode ir atrás de outra maneira.”

Os pesquisadores também usaram seu conjunto de dados para estudar como as mitoca´ndrias responderam ao estresse. As mitoca´ndrias, que evolua­ram de bactanãrias de vida livre, carregam 13 genes em seus genomas. Dentro do DNA nuclear, cerca de 1.000 genes estãode alguma forma relacionados a  função mitocondrial. “As pessoas estãointeressadas hámuito tempo em como o DNA nuclear e mitocondrial são coordenados e regulados em diferentes condições celulares, especialmente quando uma canãlula estãoestressada”, diz Replogle.

Os pesquisadores descobriram que, quando perturbavam diferentes genes relacionados a s mitoca´ndrias, o genoma nuclear respondia de maneira semelhante a muitasmudanças genanãticas diferentes. No entanto, as respostas do genoma mitocondrial foram muito mais varia¡veis. 

"Ainda háuma questãoem aberto de por que as mitoca´ndrias ainda tem seu pra³prio DNA", disse Replogle. “Uma grande lição do nosso trabalho éque um benefa­cio de ter um genoma mitocondrial separado pode ser ter uma regulação genanãtica localizada ou muito especa­fica em resposta a diferentes estressores”.

“Se vocêtem uma mitoca´ndria que estãoquebrada e outra que estãoquebrada de uma maneira diferente, essas mitoca´ndrias podem estar respondendo de forma diferente”, diz Weissman.

No futuro, os pesquisadores esperam usar Perturb-seq em diferentes tipos de células além da linhagem de células cancera­genas em que comea§aram. Eles também esperam continuar a explorar seu mapa de funções genanãticas, e esperam que outros fazm o mesmo. “Este érealmente o culminar de muitos anos de trabalho dos autores e outros colaboradores, e estou muito satisfeito em vaª-lo continuar a ter sucesso e a se expandir”, diz Norman.